זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes
Summary
להלן מוצגים שני פרוטוקולים ללמוד אינטראקציות פגוציט –Mycobacterium abscessus : הקרנת transposon מוטציה ספריה עבור לקוי תאיים חיידקי וגם הקביעה של חיידקי תאיים transcriptome מ- RNA . רצף. שתי הגישות לספק תובנות יתרונות גנומית ועיבודים transcriptomic שיפור כושר חיידקים תאיים.
Abstract
מה מבדיל בין Mycobacterium abscessus מן mycobacteria saprophytic אחרות הוא היכולת להתנגד phagocytosis על ידי מקרופאגים האדם את היכולת להתרבות בתוך תאים כאלה. התכונות הללו התקפה אלימה לבלתי abscessus מ פתוגניים, במיוחד אצל המארחים פגיע עם מחלת ריאות המבנית הבסיסית, כגון סיסטיק פיברוזיס, ברונכיאקטזיס או שחפת. כמה חולים להידבק מ abscessus עדיין לא ברור. בניגוד mycobacteria רבים, מ abscessus לא נמצא בסביבה, אבל שעשויים לשכון בתוך amoebae, phagocytes סביבתיים המייצגים מאגר פוטנציאלי עבור abscessus מ’. אכן, abscessus מ עמיד amoebal phagocytosis ונראה החיים אינטרה-אמבה להגדיל התקפה אלימה abscessus מ במודל ניסיוני של זיהום. עם זאת, מעט מאוד ידוע על התקפה אלימה מ abscessus בפני עצמו. כדי לפענח את הגנים הענקת יתרון לחיים תאיים מ’ abscessus , פותחה הקרנה של ספריית מוטנטים של transposon מ abscessus . במקביל, פותחה שיטה של RNA מן Mycobacteria תאיים החילוץ לאחר תרבות משותפת עם amoebae. שיטה זו היה מאומת והתירו את הרצף של כל מ abscessus transcriptomes בתוך התאים; מתן, בפעם הראשונה, תצוגה גלובלית על abscessus מ הסתגלות לחיים תאיים. שתי הגישות לתת לנו תובנה הגורמים התקפה אלימה מ abscessus המאפשרים abscessus מ ליישב את דרכי הנשימה אצל בני אדם.
Introduction
הסוג Mycobacterium כוללת מינים ועד אורגניזמים מזיקים saprophytic פתוגנים אנושי הגדולות. זנים פתוגניים ידועים כגון שחפת Mycobacterium, התחממות עולמית Mycobacterium ulcerans שייך קבוצת המשנה של הגדלים לאט mycobacteria (SGM). לעומת זאת, קבוצת המשנה של בצמיחה מהירה mycobacteria (RGM) מאופיין על ידי יכולתם להקים מושבות גלוי פחות מ 7 ימים באמצעי אגר. הקבוצה RGM כוללת יותר מ-180 מינים, בעיקר פתוגניים שאינם mycobacteria saprophytic. מחקרים על אינטראקציות RGM עם מארחיהם התמקדו בעיקר Mycobacterium smegmatis ומדגימים כי mycobacteria האלה מסולקות במהירות על-ידי הפעולה אחרים של מקרופאגים.
Mycobacterium abscessus הוא אחד RGM נדיר כי הם פתוגניים לבני והוא אחראי על מגוון רחב של זיהומים בעור, זיהומים רקמות רכות ועד דלקות ריאות, המופץ. מ abscessus הוא נחשב, יחד עם Mycobacterium avium, המחלה mycobacterial הראשי חולי סיסטיק פיברוזיס1.
מחקרים שונים שבוצעו במ abscessus מציינים כי mycobacterium הזה מתנהג כמו הפתוגן תאיים, מסוגלת לשרוד את התגובה אחרים של מקרופאגים ו fibroblasts הריאות, העור, אשר לא נצפית בדרך כלל ב- RGM 2 , 3 , 4. ניתוח הגנום מ abscessus זיהה משעולים חילוף החומרים הנמצאים בדרך כלל מיקרואורגניזמים סביבתיים במגע עם הקרקע, הצמחים וסביבות הימית, איפה amoebae חינם לעתים קרובות להציג5. הם הוכיחו abscessus מ’ ניחן מספר גנים התקפה אלימה לא למצוא את RGM saprophytic ואת פתוגניים שאינם, כנראה נרכשה על ידי העברה גנטית אופקית שנישה חיובית ל- exchange גנטי עשויה לאסוף חיידקים עמידים אמבה שונים.
השפעול, אחת התוצאות הבולט הראשון היה התבוננות צמיחה תאיים של מ abscessus ב מקרופאגים כמו גם באשר מ. שחפת6. מ abscessus מתנגד גם לחומצי phagosome, אפופטוזיס, autophagy, שלושה מנגנונים חיוניים של המחתרת הסלולר זיהום2. אפילו הוכח כי מ abscessus הוא מסוגל ליצור תקשורת מיידית בין phagosome את ציטוזול, סביבה יותר עשירות אולי טובה כפל חיידקים2. מעט מאוד ידוע על היתרונות גנומית מ abscessus הנו או רכשה כדי לאפשר הישרדות בסביבה תאיים. אמבה coculture היא שיטה יעילה אשר איפשר את ניתוקה של חיידקים עמידים אמבה חדשים רבים כמו Mycobacterium massiliense7,8. יכולת להתרבות בתוך amoebae נצפתה, במודל של חשוד מ abscessus בעכברים, אשר ניתן להתייעץ על התקפה אלימה גדל מ abscessus4. אחת ההשערות היא כי abscessus מ פותחו תכונות גנטיות נתקל בתוך סביבה זו כדי לשרוד בתאים phagocytic, אשר שונים אחרים RGM פתוגניים שאינם. רכישות אלה אולי טובה היכולת, התקפה שלה אלימה במארח אנושי.
הדו ח מתאר כלים ושיטות כדי להדגיש את היתרונות גנומית הוענקו ל מ abscessus כדי לשרוד בסביבת amoebae. למטרה זו, ההקרנה של מוטציות transposon מ abscessus הוא תיאר לראשונה, על המתח מסוג Acanthamoeba castellanii , אשר מאפשר הזיהוי תקינה של מוטציות לצמיחה תאיים. הקרנה שנייה מקרופאגים הוא גם דיווח, כדי לוודא אם הפגם הזה נמשכת ב לארח אדם. שנית, כדי להבין אילו מנגנונים הם רתמו ב abscessus מ להסתגל לחיים phagocytic תאים ולהגדיל התקפה שלה אלימה במארח בבעלי חיים, שיטת מותאם מ abscessus היה פיתחה, לאחר תרבות משותפת בנוכחות amoebae שמותר החילוץ של RNA הכולל מחיידקים אינטרה-amoebal. כתוצאה מכך, פותחה תצוגה מקיפה של גנים abscessus מ הנדרשים עבור חיים תאיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתנהגות של מ’ abscessus דומה הרבה יותר אופן הפעולה של SGM פתוגניים כגון מ. שחפת מאשר כל mycobacteria אחרים השייכים RGM2. רכיב המפתח ב- פתוגניות של SGM הוא היכולת שלהם לשרוד או אפילו להכפיל בתוך תאים אנטיגן, כגון מקרופאגים, תאים דנדריטים.
מ abscessus רכשה את יתרונות גנו…
Acknowledgements
אנו מאוד להכיר pr. אי. ג’יי רובין (הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, ארה ב) על המתנה היקרה של המוטציה ספריה, ד ר בן מרשל (הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת סאות’המפטון, אנגליה) עבור התיקונים של כתב היד. אנו מאוד להכיר התאחדות החולה צרפתית סיסטיק פיברוזיס “Vaincre la Mucoviscidose”, “L’Association גרגורי Lemarchal” על תמיכתם פיננסיים (RF20150501377). אנו מודים גם הסוכנות הלאומית למחקר (ANR תוכנית DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), את Région ile-de-(Domaine d’Intérêt Majeur מחלות Infectieuses et Emergentes) למימון הבתר את הנר-מ’. ל’ ל’ הוא בחור דוקטורט מ “ומוסרת Ministère de L’Enseignement et de la Recherche”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
Riferimenti
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
