貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定
Summary
ここでは、提案する食細胞-結核菌 abscessusの相互作用を調査する 2 つのプロトコル: 細菌の細胞内の欠乏と RNA から細菌細胞トランスクリプトームの決意をトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングシーケンス。両方のアプローチは、ゲノムの利点と細胞内細菌フィットネスを高めるトランスクリプトーム適応への洞察力を提供します。
Abstract
ヒトのマクロファージによって貪食に抵抗する能力とそのような細胞内増殖する能力は他の腐生抗酸菌から結核菌 abscessusを区別するもの。これらの病原性の特徴は、特に嚢胞性線維症、気管支拡張症、結核などの基になる構造の肺疾患脆弱なホストで、病原性M. abscessusをレンダリングします。M. abscessusと感染になる患者は不明のまま。多くの抗酸菌とは異なりM. abscessus環境で発見されていないが、アメーバ、 M. abscessusの潜在的な貯留層を表す環境食細胞の内部に存在可能性があります。確かに、 M. abscessus amoebal 貪食に耐性があるし、内アメーバ生活の感染実験モデルにおけるM. abscessus病原性を高めるようです。しかし、少しM. abscessus病原性自体について知られています。M. abscessus細胞内生活に利点を付与する遺伝子を解読するには、 M. abscessusトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングが開発されました。並行して、アメーバとの共培養後抗酸菌の細胞からの RNA 抽出法が開発されました。このメソッドは検証され全体M. abscessusの順序を許可したセル内トランスクリプトーム初めて、 M. abscessus細胞内生活適応上のグローバル ビューを提供します。両方のアプローチは私たちヒトの気道を植民地化するM. abscessusを有効にするとm. abscessus病原因子に洞察力を与えます。
Introduction
属には菌には種無害な腐生生物から人間の主要な病原体に至るまでにはが含まれます。結核菌、抗酸菌 marinum マイコバクテリウムの ulceransなどよく知られている病原性の種は、成長の遅いのサブグループに属する抗酸菌 (SGM)。対照的に、急速な成長のサブグループ抗酸菌 (ガンダム) は寒天培地で 7 日以内に目に見えるコロニーを形成する能力によって特徴付けられます。RGM グループは以上 180 種、主に非病原性の腐生抗酸菌で構成します。彼らのホストと RGM の相互作用に関する研究アラビノースイソメラーゼに主に焦点を当てているし、マクロファージの殺菌作用によって、これらの抗酸菌が急速に除去されることを示します。
結核菌 abscessusは人間に病原性のある珍しい RGM の一つです、感染症皮膚および軟部組織感染症から肺や播種性感染症に至るまでの広い範囲を担当。M. abscessusと見なされます、マイコバクテリウム ・ アビウム、とともに嚢胞性線維症患者1のメインの抗酸菌病原体。
M. abscessusに対して様々 な研究を示すこの結核菌が細胞内の病原体、肺および RGM で通常見られない皮膚線維芽細胞とマクロファージの殺菌の応答で生存可能なように動作します。2,3,4. M. abscessusゲノム解析が環境微生物土壌との接触で一般的に見られる代謝経路を発見、植物と水生環境、無料のアメーバが多い5を提示します。M. abscessusは腐生と非病原性の RGM は、おそらく集めるかもしれない遺伝的交流に有利なニッチ市場での遺伝子の水平伝達によって買収に見つかりませんいくつかの病原性遺伝子に恵まれていることをも示しています。様々 なアメーバ耐性菌。
実験的に、最初の顕著な結果の 1 つだったM. abscessusの結核6としてもマクロファージの細胞内増殖の観察です。M. abscessusは、ファゴソーム、アポトーシス、オートファジー、感染2細胞の抵抗の 3 つの重要なメカニズムの酸性化も抵抗します。でも、 M. abscessusはファゴソームと細胞質、細菌の増殖2を好むかもしれないより栄養豊富な環境の間の直接通信を確立することが示されています。M. abscessusが所有するか、または細胞内の環境で生存できるように取得してゲノムの利点についてほとんど知られています。アメーバ共は、結核菌 massiliense7,8として多くの新しいアメーバ耐性菌の分離を許可する効率的な方法です。アメーバ内で増殖する能力は、 M. abscessusのm. abscessus4に増加病原性を授けることができるマウスでエアロゾル化のモデルで観察されました。1 つの仮説は、 M. abscessusが他の非病原性 RGM とは異なる貪食細胞で生き残るためにこの環境内で発生した遺伝形質を開発していたことです。これらの買収は、感染する能力と人間のホストに対する病原性を好むかもしれない。
このレポートでは、ツールとアメーバの環境で生き残るためにm ・ abscessusに与えられるゲノムの利点を強調する方法について説明します。この目的のためM. abscessusトランスポゾン変異体のスクリーニングは、アカント アメーバ castellanii型株の細胞内増殖の突然変異体の欠陥の識別を可能にするに、まず説明します。マクロファージの二次検診も人間のホストでこの問題が解決しないかどうかを確認する報告されました。第二に、 M. abscessus貪食での生活に適応するために利用されているどのメカニズムを理解する細胞と動物のホスト、 M. abscessus用メソッドに対する病原性は増加開発,共培養後アメーバの存在下で amoebal 内の細菌からの総 RNA の抽出を許可しています。結果として、細胞内の生活に必要なM. abscessus遺伝子の包括的なビューが開発されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
M. abscessusの動作は、はるか RGM2に属する他のマイコ バクテリアよりも結核などの病原性の SGM の動作に似ています。SGM の病原性に重要な要素は、マクロファージなどの抗原提示細胞と樹状細胞内であっても乗算または存続する能力です。
M. abscessusは、真核生物の食細胞内で生き残るためにそのゲノム14の合計の順序…
Acknowledgements
我々 は大きく変異の貴重な贈り物の広報 E.J. ルービン (ハーバード大学医学部、ボストン、米国) を認めるライブラリ、および原稿の修正のための博士ベン マーシャル (医学部、英国・ サウザンプトン大学)。我々 は大きく金融支援 (RF20150501377) 嚢胞性線維症」Vaincre ラ Mucoviscidose「と”でグレゴリー ・ Lemarchal」のフランス語の患者会を認めます。また地方イルド フランス (ANR プログラム DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) 総合庁感謝 (ドメーヌ水利 Majeur 病気 Infectieuses et 新興階級) V.L m 員を資金調達のため。L ・ L ですから博士研究員、「ミニステール期高等エ デ ラ凝った」。
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
Riferimenti
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