Identificazione di fattori di virulenza di Mycobacterium abscessus per replica intracellulare nei fagociti
Summary
Qui, presentiamo due protocolli per studiare le interazioni fagocita –abscessus del micobatterio : lo screening di una libreria di mutante trasposone per carenza intracellulare batterica e la determinazione del trascrittoma batterica intracellulare da RNA sequenziamento. Entrambi gli approcci forniscono approfondimenti i vantaggi genomici e trascrittomica adattamenti migliorare fitness batteri intracellulari.
Abstract
Ciò che differenzia abscessus del micobatterio da altri micobatteri saprofiti è la capacità di resistere alla fagocitosi dai macrofagi umani e la capacità di moltiplicarsi all’interno di tali cellule. Questi tratti di virulenza rendono M. abscessus patogeni, soprattutto in host vulnerabili con sottostante malattia polmonare strutturali, come la fibrosi cistica, bronchiectasie o tubercolosi. Come pazienti essere infettati con M. abscessus rimane poco chiaro. A differenza di molti micobatteri, M. abscessus non viene trovato nell’ambiente ma potrebbe risiedere all’interno di amebe, fagociti ambientali che rappresentano un potenziale serbatoio per M. abscessus. Infatti, M. abscessus è resistente alla fagocitosi amoebal e la vita intra-ameba sembra aumentare M. abscessus virulenza in un modello sperimentale di infezione. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa M. abscessus virulenza in sé. Per decifrare i geni che conferiscono un vantaggio alla vita intracellulare M. abscessus , uno screening di una libreria di mutante del trasposone M. abscessus è stato sviluppato. In parallelo, è stato sviluppato un metodo di estrazione di RNA da micobatteri intracellulari dopo co-coltura con amebe. Questo metodo è stato convalidato e permesso il sequenziamento dell’intero M. abscessus trascrittomi all’interno delle cellule; fornire, per la prima volta, una visione globale su M. abscessus adattamento alla vita intracellulare. Entrambi gli approcci ci danno uno spaccato di fattori di virulenza di M. abscessus che permettono M. abscessus a colonizzare le vie aeree negli esseri umani.
Introduction
Il genere Mycobacterium comprende specie che vanno da organismi saprofiti innocui ai principali agenti patogeni umani. Ben note specie patogene come tubercolosi del micobatterio, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans appartengono al sottogruppo di crescita lenta micobatteri (SGM). In contrasto, il sottogruppo di rapida crescita micobatteri (RGM) è caratterizzato dalla loro capacità di formare colonie visibili in meno di 7 giorni su agar. Il gruppo RGM comprende più di 180 specie, principalmente micobatteri saprofiti non patogeni. Studi sulle interazioni di RGM con i loro ospiti si sono concentrati principalmente su Mycobacterium smegmatis e dimostrano che questi micobatteri sono rapidamente eliminati mediante l’azione battericida dei macrofagi.
Mycobacterium abscessus è uno della RGM rari che sono patogeni per l’uomo ed è responsabile di una vasta gamma di infezioni che vanno dalla pelle e infezioni dei tessuti molli per le infezioni polmonari e diffuse. M. abscessus è considerato, insieme di avium del micobatterio, per essere il principale agente patogeno micobatterica in fibrosi cistica pazienti1.
Vari studi su M. abscessus indicano che questo micobatterio si comporta come un agente patogeno intracellulare, capace di sopravvivere la risposta battericida dei macrofagi e fibroblasti nei polmoni e pelle, che non è osservata solitamente in RGM 2 , 3 , 4. analisi del genoma di M. abscessus ha identificato le vie metaboliche in genere presenti nei microrganismi ambientali a contatto con il terreno, piante e ambienti acquatici, dove amebe libera sono spesso presentano5. Essi hanno anche dimostrato che M. abscessus è dotata di diversi geni di virulenza non trovate la RGM saprofiti e non patogeni, probabilmente si è acquistata dal trasferimento orizzontale del gene in una nicchia favorevole di scambio genetico che potrebbe raccogliere vari batteri resistenti ameba.
Sperimentalmente, uno dei primi risultati sorprendenti è stato l’osservazione di crescita intracellulare del M. abscessus in macrofagi anche per quanto riguarda la tubercolosi di M.6. M. abscessus resiste anche l’acidificazione del fagosoma, apoptosi e autophagy, tre meccanismi essenziali della resistenza cellulare all’ infezione2. Si ha anche dimostrato che M. abscessus è in grado di stabilire una comunicazione immediata tra phagosome e citosol, un ambiente più ricco di nutrienti che potrebbe favorire la moltiplicazione batterica2. Pochissimo è conosciuto circa i vantaggi di genomici che M. abscessus possiede o ha acquisito per permettere la sopravvivenza in un ambiente intracellulare. Coculture ameba è un metodo efficace che ha permesso l’isolamento di molti nuovi batteri resistenti ameba come Mycobacterium massiliense7,8. Una capacità di moltiplicarsi all’interno di amebe è stata osservata, in un modello di nebulizzazione di M. abscessus in topi, che possono conferire una maggiore virulenza di M. abscessus4. Un’ipotesi è che M. abscessus aveva sviluppato tratti genetici all’interno di questo ambiente per sopravvivere nelle cellule fagocitiche, che sono diverse da altri non-patogeni RGM rilevate. Queste acquisizioni potrebbero favorire la capacità di diffondersi e sua virulenza nell’ospite umano.
Questo rapporto descrive metodi e strumenti per evidenziare i vantaggi genomici ha conferiti al M. abscessus di sopravvivere nell’ambiente di amebe. Per questo scopo, lo screening di mutanti di M. abscessus trasposone descritto prima, il ceppo di tipo Acanthamoeba castellanii , che permette l’identificazione di difettoso del mutante per crescita intracellulare. Una seconda proiezione nei macrofagi è anche segnalata, per confermare se questo difetto persiste nell’ospite umano. In secondo luogo, per capire quali meccanismi sono imbrigliati in M. abscessus per adattarsi alla vita in fagocitica cellule e aumento sua virulenza nell’animale ospite, un metodo adattato specificamente per M. abscessus è stato sviluppato, dopo co-coltura in presenza di amebe che ha permesso l’estrazione di RNA totale da batteri intra-amoebal. Di conseguenza, una visione completa di M. abscessus geni che sono necessari per una vita intracellulare è stata sviluppata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il comportamento di M. abscessus è molto più simile al comportamento di SGM patogeni come M. tuberculosis rispetto a qualsiasi altri micobatteri appartenendo a RGM2. L’elemento chiave nella patogenicità di SGM è la loro capacità di sopravvivere o addirittura si moltiplicano all’interno di cellule presentanti l’antigene, quali i macrofagi e cellule dendritiche.
M. abscessus ha acquisito alcuni vantaggi genomiche come mostrato dalla sequenz…
Acknowledgements
Riconosciamo notevolmente Pr. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) per il dono prezioso del mutante biblioteca e Dr. Ben Marshall (facoltà di medicina, Università di Southampton, UK) per le correzioni del manoscritto. Riconosciamo notevolmente l’associazione paziente francese per fibrosi cistica “Vaincre la Mucoviscidose” e “L’Association Gregory Lemarchal” per il loro sostegno finanziario (RF20150501377). Ringraziamo anche l’Agenzia nazionale per la ricerca (programma ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) e la Région Ile de France (Domaine d’Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) la borsa di post-dottorato a VL-M. L. L. è un dottorato dalla “Ministère de il L’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
Riferimenti
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