Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

रोगी-व्युत्पंन ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के 3-आयामी संस्कृति के लिए Hyaluronic-एसिड आधारित Hydrogels

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58176
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 2Department of Bioengineering, Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

Summary

यहां, हम रोगी के तीन आयामी संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान orthogonally स्वरित्र के भीतर ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं व्युत्पंन मस्तिष्क मैट्रिक्स की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया माल । इस दृष्टिकोण में एक इन विट्रो, प्रयोगात्मक मंच है कि vivo ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में आम तौर पर संस्कृति में खो के कई विशेषताओं का कहना है प्रदान करता है ।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) सबसे आम है, अभी तक सबसे घातक, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र कैंसर । हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों पर ध्यान केंद्रित किया है कि कैसे extracellular मैट्रिक्स (ECM) अद्वितीय मस्तिष्क पर्यावरण की, जैसे hyaluronic एसिड (HA), जीबीएम प्रगति और आक्रमण की सुविधा. हालांकि, इन विट्रो संस्कृति मॉडल में सबसे जीबीएम कोशिकाओं के बाहर एक ECM के संदर्भ में शामिल हैं । जीबीएम कोशिकाओं के Murine xenografts आमतौर पर के रूप में अच्छी तरह से उपयोग किया जाता है । हालांकि, vivo मॉडल में यह मुश्किल ट्यूमर व्यवहार करने के लिए जटिल ट्यूमर microenvironment की व्यक्तिगत सुविधाओं के योगदान को अलग करने के लिए बनाते हैं । यहां, हम एक हा hydrogel-आधारित, तीन आयामी (3 डी) संस्कृति मंच है कि शोधकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से हा एकाग्रता और कठोरता को बदलने के लिए अनुमति देता है का वर्णन । उच्च आणविक भार हा और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) शामिल hydrogels, जो रहते कोशिकाओं की उपस्थिति में माइकल प्रकार के अलावा crosslinked हैं । रोगी की 3 डी hydrogel संस्कृतियों-व्युत्पंन जीबीएम कोशिकाओं के रूप में अच्छी के रूप में व्यवहार्यता और प्रसार दर प्रदर्शन, या से बेहतर है, जब मानक gliomaspheres के रूप में संस्कृति । hydrogel प्रणाली भी ECM-mimetic पेप्टाइड्स के शामिल करने के लिए विशिष्ट सेल ECM बातचीत के प्रभाव को अलग करने के लिए सक्षम बनाता है । Hydrogels ऑप्टिकली पारदर्शी ताकि जीवित कोशिकाओं 3 डी संस्कृति में imaged किया जा सकता है । अंत में, हा hydrogel संस्कृतियों आणविक और सेलुलर विश्लेषण के लिए मानक तकनीकों के साथ संगत कर रहे हैं, पीसीआर सहित, पश्चिमी सोख्ता और cryosectioning इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा पीछा किया ।

Introduction

तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों दोहराऊंगा कोशिकाओं और उनके आसपास के extracellular मैट्रिक्स (ECM) के बीच बातचीत देशी ऊतकों में बेहतर उनके दो आयामी (2d) समकक्षों1,2से । ऊतक इंजीनियरिंग में प्रगति परिष्कृत, 3 डी संस्कृति प्लेटफार्मों कि 1 में नियंत्रित जांच सक्षम) कैसे रासायनिक और मैट्रिक्स microenvironment के भौतिक घटकों को प्रभावित सेल व्यवहार और 2) नई चिकित्सीय की प्रभावकारिता उपज है 2कैंसर सहित रोगों की एक संख्या के लिए रणनीतियों, । इन विट्रो मॉडल में इस तरह के अंत: स्रावी और प्रतिरक्षा संकेतों के रूप में प्रणालीगत कारकों, के लिए खाते में नहीं कर सकते, और इस तरह vivo मॉडल में पूरी तरह से प्रतिस्थापित नहीं कर सकता, वे reproducibility सहित कई लाभ प्रदान, प्रयोगात्मक नियंत्रण, सामर्थ्य और गति । यहाँ, हम मस्तिष्क के उपयोग का वर्णन-mimetic hydrogels जिसमें रोगी की 3 डी संस्कृतियों-व्युत्पन्न मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं ट्यूमर शरीर विज्ञान के कई पहलुओं पर कब्जा, विशेष रूप से, उपचार प्रतिरोध प्राप्त करने की गतिशीलता3. इन विट्रो तरीकों में अन्य की तुलना में, इन संस्कृतियों बेहतर vivo ट्यूमर मॉडल और नैदानिक टिप्पणियों में प्रतिनिधित्व3.

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) सबसे अक्सर और घातक मस्तिष्क में उद्भव कैंसर है, केवल 1-2 साल4,5का एक औसत अस्तित्व के साथ । हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों जीबीएम6,7,8में ट्यूमर मैट्रिक्स पर्यावरण के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है । अद्वितीय मस्तिष्क ECM जीबीएम सेल प्रवास, प्रसार, और चिकित्सीय प्रतिरोध6,7,8,9,10,11 प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है , 12. Hyaluronic एसिड (हा) मस्तिष्क में एक प्रचुर मात्रा में glycosaminoglycan (झूठ) है, जहां यह अंय परिहास और proteoglycans के साथ बातचीत के लिए एक hydrogel की तरह जाल13फार्म । कई अध्ययनों से बताया है जीबीएम ट्यूमर में हा एक्सप्रेस और इसके बाद कैंसर प्रगति पर प्रभाव8,9,13,14,15,16 ,17. अन्य ECM घटक भी जीबीएम ट्यूमर वृद्धि और आक्रमण6,7,15,18को प्रभावित करते हैं । उदाहरण के लिए, fibronectin और vitronectin, जो आम तौर पर जीबीएम में व्यक्त कर रहे हैं, heterodimerization सेल की सतह integrin रिसेप्टर्स के "RGD" अनुक्रम के लिए बाध्यकारी के माध्यम से प्रेरित और ट्यूमर अस्तित्व को बढ़ावा देने कि जटिल संकेतन कैस्केडिंग आरंभ19 ,20,21. इसके अलावा जैव रासायनिक प्रभाव, ऊतक मैट्रिक्स के भौतिक गुणों को भी प्रभावित जीबीएम प्रगति22,23.

उपचार के लिए प्रतिरोध के नित्य अधिग्रहण जीबीएम घातकता4के मुख्य ड्राइवरों में से एक है । 2d या gliomasphere मॉडल में आशाजनक परिणाम दिखा ड्रग्स बाद में पशु अध्ययन और नैदानिक मामलों3में विफल रहे हैं, यह दर्शाता है कि microenvironmental कारकों के प्रभाव काफी जीबीएम ट्यूमर प्रतिक्रिया1में योगदान दिया । जबकि पशु मॉडल एक 3 डी प्रदान कर सकते हैं, शारीरिक रूप से उपयुक्त microenvironment रोगी कोशिकाओं xenografted और नैदानिक प्रासंगिक परिणाम उत्पंन24,25, vivo में मस्तिष्क microenvironment की जटिलता यह निर्धारित करने के लिए जो सुविधाओं, सेल मैट्रिक्स बातचीत सहित, विशिष्ट जैविक परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है चुनौतीपूर्ण बनाता है । नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान से सरलीकृत संस्कृति प्लेटफार्मों के उपयोग में लाभ होगा जिसमें जैव रासायनिक और भौतिक गुणों को परिभाषित किया गया है ।

विपरीत पहले जीबीएम ट्यूमर microenvironment26,27 जो ECM के व्यक्तिगत जैव रासायनिक और भौतिक सुविधाओं पर सच ओर्थोगोनल नियंत्रण हासिल नहीं किया है के जैव सामग्री मॉडल की रिपोर्ट यहां रिपोर्ट जीबीएम सेल phenotype के लिए कई स्वतंत्र सुविधाओं के योगदान के युग्मन सक्षम बनाता है । यहां, हम रोगी-व्युत्पंन जीबीएम कोशिकाओं की 3 डी संस्कृति के लिए एक हा आधारित, orthogonally स्वरित्र, hydrogel प्रणाली प्रस्तुत करते हैं । Hydrogels दो बहुलक घटकों से बनते हैं: 1) जैविक रूप से सक्रिय हा और 2) जैविक रूप से निष्क्रिय पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) । खूंटी एक व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है और कम प्रोटीन सोखना और ंयूनतम immunogenicity28के साथ संगत हाइड्रोफिलिक सामग्री । यहां, ग्लुकुरोनिक एसिड moieties का हा जंजीरों पर लगभग 5% thiol समूहों के साथ कार्यात्मक के लिए crosslinking सक्षम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4 हाथ-खूंटी माइकल के माध्यम से maleimides-प्रकार के अलावा समाप्त कर रहे हैं । शरीर में अपने सबसे आम रूप में, हा उच्च आणविक वजन (HMW) जंजीरों में मौजूद है । यहां, HMW हा के संशोधन के एक कम डिग्री (500-750 केडीए) CD4429सहित हा और उसके सेल रिसेप्टर्स की देशी बातचीत को बनाए रखने में मदद करता है. maleimides के लिए कुल thiols के एक निरंतर दाढ़ अनुपात को बनाए रखते हुए हा-thiol के लिए खूंटी-thiol प्रतिस्थापन करके, हा एकाग्रता परिणामस्वरूप hydrogels के यांत्रिक गुणों से जोड़ा जा सकता है । इसके अलावा, stoichiometric नियंत्रण प्रत्येक 4 हाथ-खूंटी पर maleimide-समाप्त हथियारों की एक निर्धारित औसत संख्या के लिए cysteine समाप्त पेप्टाइड्स संयुग्मी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ECM के शामिल-व्युत्पंन, चिपकने वाला पेप्टाइड्स integrins के साथ प्रसंस्कृत कोशिकाओं पर बातचीत में सक्षम बनाता है, जिसके माध्यम से जैव रासायनिक और रासायनिक संकेतों1transduced हैं । Maleimide-thiol इसके अलावा बहुत जल्दी शारीरिक स्थितियों के तहत होता है, कोशिका encapsulation के लिए आवश्यक समय को कम करने और रोगी व्युत्पंन कोशिकाओं का अधिकतम अस्तित्व । इसके अलावा, hydrogel संस्कृतियों ठेठ ऊतक नमूना की तरह व्यवहार किया जा सकता है और पश्चिमी सोख्ता, प्रवाह cytometry, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला सहित मानक लक्षण वर्णन तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं । निंनलिखित प्रोटोकॉल hydrogels निर्माण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन, रोगी की 3 डी संस्कृतियों-व्युत्पंन जीबीएम कोशिकाओं और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए तकनीकों की स्थापना ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी मानव ऊतक संग्रह कदम संस्थागत अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत किए गए थे ।

1. Hyaluronic अम्ल की Thiolation

नोट: दाढ़ अनुपात carboxylate समूहों की कुल संख्या के संबंध में कहा जब तक अंयथा निर्दिष्ट कर रहे हैं ।

  1. भंग ५०० सोडियम hyaluronate के मिलीग्राम (हा, 500-750 केडीए) में 10 मिलीग्राम/मिलीलीटर में आसुत जल (दिः2O) एक आटोक्लेव में निष्फल, २५० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी ।. समाधान हिलाओ (~ २०० rpm) कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए पूरी तरह से भंग हा । thiolation प्रक्रिया के दौरान सरगर्मी प्रतिक्रिया रखने के लिए एक बार और चुंबकीय हलचल प्लेट हलचल का प्रयोग करें ।
  2. ०.१ एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) का प्रयोग, ५.५ के लिए हा समाधान के पीएच समायोजित करें । 1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) के ६९.६ मिलीग्राम (0.25 x दाढ़ अनुपात) बाहर वजन ।
    नोट: हालांकि undissolved edc सीधे हा समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है, यह आमतौर पर दिः2के 1 मिलीलीटर में edc पहले भंग करने के लिए आसान है हे और फिर जल्दी से edc समाधान जोड़ने के लिए हा समाधान । दिः2के 1 मिलीलीटर में पूर्व विघटन-१.३ और १.४ चरणों में प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ने से पहले N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) और cystamine dihydrocholoride के साथ भी किया जा सकता है ।
  3. जोड़ें १७.९ मिलीग्राम (0.125 x दाढ़ अनुपात) एन एच एस की प्रतिक्रिया के लिए. ५.५ ०.१ मीटर एचसीएल का उपयोग कर प्रतिक्रिया समाधान के पीएच समायोजित करें और ४५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया की मशीन ।
  4. cystamine dihydrochloride की प्रतिक्रिया समाधान में ७०.० मिलीग्राम (0.25 x दाढ़ अनुपात) जोड़ें । ६.२५ करने के लिए पीएच समायोजित करने के लिए ०.१ मीटर सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) का उपयोग करें । सरगर्मी से रात भर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया की मशीन ।
  5. अगले दिन पर, 1 M NaOH का उपयोग करने के लिए लगभग 8 प्रतिक्रिया समाधान का पीएच समायोजित करें । dithiothreitol (डीटीटी) की प्रतिक्रिया के लिए १९२ मिलीग्राम (4x दाढ़ अनुपात) जोड़ें । डीटीटी के अलावा 8 को वापस पीएच समायोजित करें और कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए सरगर्मी छोड़ दें ।
  6. pH को 4 पर एडजस्ट करने के लिए 1 M HCl का उपयोग करें । पूर्व लथपथ डायलिसिस झिल्ली में पूरी प्रतिक्रिया मिश्रण स्थानांतरण (आणविक वजन कट-बंद के आसपास 13 केडीए) और दिः2ओ पूर्व के खिलाफ dialyze पीएच 4 के लिए समायोजित ।
    नोट: डायलिसिस के लिए दिः2ओ की मात्रा कम से ४० बार प्रतिक्रिया व्यक्त की है हा समाधान (उदाहरण के लिए, दिः2ओ, पीएच 4) के 2 एल में ५० मिलीलीटर नमूने की मात्रा होना चाहिए ।
  7. डायलिसिस समाधान बदलें (दिः2ओ, पीएच 4) कमरे के तापमान पर 3 दिनों के लिए दो बार दैनिक ।
  8. एक ०.२२ µm झिल्ली, वैक्यूम चालित फिल्टर के माध्यम से dialyzed समाधान फ़िल्टर । फ़्लैश फ्रीज समाधान thiolated के तरल नाइट्रोजन में हा । 2 दिनों में सूखे नमूनों को फ्रीज करने के लिए एक lyophilizer का प्रयोग करें । शुष्क रूप में Thiolated हा एक वैक्यूम सील desiccator में संग्रहित किया जा सकता है-20 डिग्री सेल्सियस से कम 6 महीने के लिए ।
  9. thiolation की डिग्री का निर्धारण करने के लिए, Ellman के परीक्षण और/या प्रोटॉन एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी30,31का उपयोग करें ।

2. Crosslinking सामग्रियों की तैयारी

  1. भंग वांछित एकाग्रता में thiolated हा (इस उदाहरण में, १३.३ मिलीग्राम/एमएल) HEPES में (20 है हांक संतुलित नमक खारा (HBSS) बफर में मिमी HEPES), एक 8-9 के पीएच के भीतर गिर समायोजित करने के लिए एक एंबर शीशी में) परिवेश प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए । समाधान को लगातार चमचे से रखें ।
    नोट: thiols संयुग्मित के बीच डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन के लिए हा हो सकता है अगर पीएच 8 से ऊपर है, समाधान एकाग्रता बहुत अधिक है, या समाधान बहुत लंबे समय के लिए जमाना से पहले सरगर्मी छोड़ दिया है । इस समस्या से बचने के लिए, नीचे उपयोग thiolated हा के 15 मिलीग्राम/एमएल और hydrogels बनाने के 2 घंटे के भीतर thiolated हा भंग ।
  2. भंग 4 भुजा-खूंटी-maleimide (खूंटी-मल, 20 केडीए) और 4 एआरएम-खूंटी-thiol (खूंटी-thiol, 20 केडीए) में फास्फेट बफर खारा (पंजाब), पीएच ७.४, ५० मिलीग्राम/एमएल खूंटी-मल और खूंटी-thiol स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए.
    नोट: यह पूरी तरह से खूंटी रिएजेंट भंग करने के लिए कम से 1 घंटे लगते हैं ।
  3. अगर ECM-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स को जोड़ना है, तो एक स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए पंजाब में cysteine-युक्त पेप्टाइड को भंग करें ।
    नोट: 2-4 mM का शेयर एकाग्रता का उपयोग करें ।
  4. उन्हें साफ करने के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए इथेनॉल में सिलिकॉन रबर मोल्ड सोख लें और फिर उन्हें नसबंदी के लिए आटोक्लेव.

3. Hydrogel Crosslinking और कोशिका encapsulation

नोट: यहां एक उदाहरण के रूप में, चार व्यक्ति के encapsulation, ८० µ एल hydrogels के साथ ०.५% (डब्ल्यू/वि.) हा और 1 केपीए के संपीड़न मापांक3वर्णित है । कृपया 1 टेबल देखें उदाहरण के लिए व्यंजनों है कि अलग गुण के साथ hydrogels उपज: दो hydrogels integrin-बाध्यकारी पेप्टाइड RGD और दो hydrogels cysteine टोपियां शामिल पेप्टाइड गतिविधि के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल । रोगी-व्युत्पंन जीबीएम कोशिकाओं की एकाग्रता बोने ५००,००० कोशिकाओं/

  1. खूंटी-मल स्टॉक समाधान पतला (५० मिलीग्राम/एमएल, से कदम २.२) को १२.५ मिलीग्राम/एमएल को जोड़कर शेयर समाधान के ४० µ l को १२० µ l पंजाबियों. दो १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में पतला समाधान भाजित इतना है कि प्रत्येक ट्यूब है ८० µ एल
  2. शेयर RGD समाधान के 16 µ एल जोड़ें (२.८ मिमी, से कदम २.३) एक ट्यूब और शेयर cysteine समाधान के 16 µ एल (२.८ मिमी, से कदम २.३) दूसरी ट्यूब के लिए । भंवर मिश्रण करने के लिए । खूंटी-मल-RGD या खूंटी-मल-CYS समाधान बर्फ पर कदम ३.९ में उपयोग तक रखें ।
    नोट: प्रक्रिया के रूप में वर्णित यहां पैदावार hydrogels के साथ ~ १४० पेप्टाइड के µ एम । यह लगभग हर 8 उपलब्ध खूंटी हथियारों से बाहर 1 के बराबर है एक पेप्टाइड के साथ कब्जा किया जा रहा है । यह cysteine-समाप्त पेप्टाइड्स के दाढ़ अनुपात उपलब्ध maleimide समूहों को बदलने के द्वारा अलग किया जा सकता है । सामांय में, पेप्टाइड के २८० µ मीटर की एक अधिकतम एकाग्रता प्राप्त किया जा सकता है, जबकि अभी भी hydrogel crosslinking के लिए उपलब्ध maleimide समूहों की पर्याप्त संख्या छोड़ने ।
  3. पतला खूंटी-thiol स्टॉक समाधान (५० मिलीग्राम/एमएल, २.२ कदम से) के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल के 4 µ एल मिश्रण से ५० mg/एमएल स्टॉक समाधान की ३६ µ के साथ/ जोड़ के १२० µ l को भंग कर, चरण २.१ से thiolated हा मिश्रण को.
    नोट: HMW हा के समाधान बहुत चिपचिपा रहे हैं । इस प्रकार, हम व्यापक छिद्र micropipette टिप का उपयोग करने के लिए समाधान हस्तांतरण की सलाह देते हैं । पिपेट धीरे micropipette टिप की दीवारों से चिपके हुए समाधान से बचने के लिए और माप सटीकता में सुधार करने के लिए ।
  4. एक गैर ऊतक संस्कृति 12-अच्छी तरह से थाली इलाज के प्रत्येक कुआं में साफ, शुष्क molds (चरण २.४ में तैयार) प्लेस । एक पिपेट टिप के स्वच्छ, कुंद अंत का उपयोग करना, जेल मोल्ड प्रेस और मोल्ड और अच्छी तरह से थाली के नीचे के बीच डबल जांच सील ।
    नोट: रिसाव को रोकने के लिए फिर से सही encapsulation से पहले सील की जांच करें ।
  5. यात्रा प्रसंस्कृत जीबीएम कोशिकाओं, अलग कर देना एकल कोशिकाओं के लिए और कोशिका एकाग्रता निर्धारित के रूप में पहले3वर्णित है ।
    नोट: कुछ जीबीएम रेखाओं को एकल कक्षों में असंबद्ध नहीं किया जा सकता । इस मामले में, पूरे gliomaspheres समझाया जा सकता है । हालांकि, reproducibility में सुधार करने के लिए सटीक सेल गिनती के बाद असंबद्ध एकल कोशिकाओं को तैयार । gliomasphere passaging के लिए प्रोटोकॉल अलग प्रयोगशालाओं के बीच बदलता है और इनमें से कई की संभावना hydrogel encapsulation के साथ संगत कर रहे हैं ।
    1. अनुशंसित केंद्रापसारक 5 मिनट के लिए ५०० x जी पर gliomaspheres supernatant निकालें और सेल गोली के लिए सेल पृथक्करण एंजाइम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । फिर, 5 मिनट के लिए मशीन, धीरे से आंदोलन करने के लिए ट्यूब दोहन ।
    2. पूर्ण संस्कृति मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें (५० एनजी/एमएल EGF, 20 एनजी/एमएल FGF-2, 25 µ जी/एमएल हेपरिन, G21 अनुपूरक और 1% पेनिसिलिन/streptomycin में DMEM/F12) कोशिकाओं के लिए ।
    3. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर फिर से केंद्रापसारक और supernatant हटा दें । अंत में, पूर्ण माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend और एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से निलंबित कोशिकाओं को पारित । (अनुशंसित) बरामद कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए पूर्ण माध्यम के एक अतिरिक्त 4 मिलीलीटर के साथ छलनी धोने ।
  6. एक hemocytometer का उपयोग कर निलंबन में कोशिकाओं की एकाग्रता का अनुमान लगाएं । 2 में सेल सस्पेंशन भाजित ट्यूबों, जहां प्रत्येक ट्यूब शामिल ~ ८०,००० कोशिकाओं । 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक; आम तौर पर, ८०,००० कोशिकाओं को २ ८० µ l hydrogels कर देगा ।
  7. supernatant निकालें और खूंटी-मल-RGD समाधान के ८० µ एल में एक गोली और एक दूसरी गोली resuspend (चरण ३.१ में तैयार) खूंटी-मल-CYS समाधान के ८० µ एल में ।
  8. एक २०० µ एल का उपयोग करना, व्यापक छिद्र micropipette टिप, वितरण ४० µ एल के हा समाधान (ऊपर से कदम ३.३) प्रत्येक रबर सिलिकॉन मोल्ड में (के रूप में चरण में तैयार ३.४) ।
  9. एक २०० µ एल, चौड़े छिद्र micropipette टिप का प्रयोग, खूंटी के ४० µ एल-मल-CYS या खूंटी-मल-RGD कोशिका समाधान मोल्ड में हा समाधान के साथ मिश्रण । पिपेट ऊपर और नीचे जल्दी से कोई 10 से अधिक बार । प्रत्येक जेल संस्कृति तैयार किया जा रहा है के लिए दोहराएँ ।
    ध्यान दें: इस कदम अभ्यास लेता है, के बाद से प्रारंभिक जमाना होता है जल्दी (30 एस के भीतर) । मोल्ड में विभिन्न स्थानों के लिए टिप चलती है, जबकि भी मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट. हमेशा हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए तरल स्तर से नीचे टिप रखें । समाधान भी कई बार जेल micropipette टिप के अंदर गठन हो सकता है के रूप में मिश्रण नहीं है । खूंटी-मल-CYS और खूंटी-मल-RGD की वांछित RGD पेप्टाइड एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए अलग अनुपात में जोड़ा जा सकता है ।
  10. एक ३७ डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति मशीन में 5-10 मिनट के लिए जेल-encapsulated कोशिकाओं युक्त अच्छी प्लेट प्लेस प्रतिक्रिया के पूरा सुनिश्चित करने के लिए ।
  11. गठन जैल के साथ एक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 2-2.5 मिलीलीटर जोड़ें । एक बाँझ का प्रयोग करें, 2 µ l पिपेट टिप या माइक्रो-रंग, धीरे मोल्ड और जेल अलग करने के लिए. मोल्ड को वेल प्लेट से हटाने के लिए पूर्व निष्फल संदंश का प्रयोग करें । अच्छी तरह से थाली वापस सेल मशीन (३७ ° c और 5% सह2) संस्कृति और भविष्य के प्रयोगों के लिए प्लेस ।
    नोट: जेल संस्कृतियों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए मोल्ड को लंबवत रूप से ऊपर की ओर खींचें । सामांय में, जेल संस्कृतियों में मध्यम हर 3-4 दिन प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । ध्यान रखना नहीं महाप्राण hydrogels जब मध्यम निकाल रहा है । यह एक मुद्दा है, तो हम एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने की सलाह देते हैं । bioluminescence इमेजिंग कक्ष संख्या ट्रैक करने के लिए नियोजित है, तो जीबीएम कक्षों पहले वर्णित3के रूप में encapsulation से पहले lentivirus एन्कोडिंग constitutively luciferase अभिव्यक्ति के साथ transduced होना चाहिए । bioluminescence इमेजिंग के लिए, 1 मिमी के D-luciferin संस्कृति मध्यम 1 ज करने के लिए luminescence इमेजिंग से पहले जोड़ें ।

4. पश्चिमी सोख्ता के लिए Lysate तैयारी

  1. चिल बर्फ पर १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों (प्रति जेल नमूने 1) । शांत 4 ° c करने के लिए केंद्रापसारक ।
  2. अच्छी तरह से प्लेट से मध्यम निकालें । सर्द microcentrifuge ट्यूबों में जैल स्थानांतरण ।
  3. फॉस्फेट अवरोधकों के साथ RIPA बफर के १०० µ एल जोड़ें ।
  4. एक के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग 20 जी सुई, ऊपर सुई के माध्यम से पूरे मिश्रण धक्का द्वारा जेल तोड़ कम से 20 बार.
  5. फ्लैश बेंच शीर्ष microcentrifuge का उपयोग कर नमूना स्पिन और बर्फ पर नमूना वापस जगह है ।
  6. भंवर नमूने संक्षेप में 20 मिनट की कुल के लिए हर 5 मिनट ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १४००० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
  8. स्थानांतरण supernatant नए, पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूबों और स्टोर पर-20 ° c (अल्पकालिक) या और-८० ° c (दीर्घकालिक) । पहले बताया3के रूप में मानक कार्यविधियों का उपयोग कर जेल ट्रो, प्रदर्शन ।

5. Hydrogel संस्कृतियों से प्रवाह Cytometry के लिए एकल कोशिकाओं को निकालने

  1. मध्यम और स्थानांतरण जेल संस्कृति (३.११ कदम से) एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में निकालें ।
  2. सेल पृथक्करण एंजाइम (जैसे, TrypLE एक्सप्रेस) के ५०० µ एल के साथ मशीन 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर, कभी भी आंदोलन करने के लिए ट्यूब फ़्लिक ।
  3. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में मिश्रण पूर्ण माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ स्थानांतरण । ट्यूब को बर्फ पर लगाएं ।
  4. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज पर एक 20G सुई देते हैं । धीरे से सेल निलंबन ऊपर और सुई के माध्यम से नीचे खींच 8 बार ।
  5. एक नया ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में ७० µm सेल छलनी के माध्यम से मिश्रण प्रवाह । किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए छलनी के माध्यम से एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर पूर्ण मध्यम लागू करें ।
  6. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर नमूना केंद्रापसारक supernatant निकालें और प्रवाह cytometry के लिए वांछित बफर में गोली resuspend (मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर3) ।

6. Cryopreservation के लिए Hydrogels की धारा

  1. जेल संस्कृतियों से मध्यम निकालें (३.११ कदम से) ।
  2. 4 ° c पर रात भर 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 2 मिलीलीटर के साथ जेल संस्कृतियों की मशीन ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  3. अगले दिन, पीएफए निकालें । जैल और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन के लिए पंजाब में 5% सुक्रोज के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. पंजाब में 20% सुक्रोज के 2 मिलीलीटर और 30 मिनट के लिए मशीन के साथ 5% सुक्रोज समाधान बदलें ।
  5. पंजाबियों में ताजा 20% सुक्रोज के 2 मिलीलीटर के साथ सुक्रोज समाधान बदलें और एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए मशीन ।
  6. एक तीसरी बार के लिए, सुक्रोज समाधान की जगह पंजाब में ताजा 20% सुक्रोज के 2 मिलीलीटर के साथ । 4 ° c रात भर में मशीन ।
  7. इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक में 20% सुक्रोज तैयार करें ।
    नोट: अक्टूबर की चिपचिपाहट के कारण, सुक्रोज के विघटन के लिए कुछ समय (रात भर के लिए) ले जा सकते हैं । हम आंदोलन को बनाए रखने के विघटन के दौरान एक शेखर पर मिश्रण डालने की सलाह देते हैं ।
  8. अगले दिन, 20% सुक्रोज समाधान निकालें और धीरे जेल पर OCT समाधान में 20% सुक्रोज डालो । पूरे जेल को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें । 3 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  9. एक बड़े, सपाट रंग का उपयोग कर एक एंबेडिंग मोल्ड के केंद्र में जेल स्थानांतरण; यह सावधानी से किया जाना चाहिए जेल हानिकारक से बचने के लिए ।
  10. ठंडा 2-सूखी बर्फ की एक अतिरिक्त के साथ एक cryochamber के अंदर methylbutane ।
  11. एंबेडिंग मोल्ड शुद्ध OCT (कोई सुक्रोज) के साथ भरें । मोल्ड के ऊपर किनारे के बस के नीचे भरें ।
  12. ठंडा 2-methylbutane में विसर्जन द्वारा hydrogel नमूना फ्रीज और फिर अनुभाग में आगे बढ़ना ।
  13. एक cryostat का उपयोग कर नमूना अनुभाग; धारा मोटाई की 10-18 µm और आसपास के खंड तापमान-26 ° c अनुशंसित है ।
  14. पहले वर्णित3के रूप में खोदी गई जेल संस्कृति पर मानक immunostaining प्रक्रियाओं, निष्पादित करें ।
    नोट: पीएफए अड़चन और यलो जाना जाता है । स्थानीय रूप से लागू मानकों और विनियमों के अनुसार पीएफए को संभालें और निपटाना करें ।

7. Hydrogel में नमूनों से कुल आरएनए निष्कर्षण

नोट: यहां, हम एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन (सामग्री की मेज देखें) को hydrogel संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं से कुल आरएनए निकालने । बफ़र्स और सभी सामग्री का उपयोग किट के भीतर उपलब्ध हैं ।

  1. कल्चरल मीडियम निकालें. १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में hydrogel संस्कृति हस्तांतरण करने के लिए व्यापक बोर टिप के साथ एक P1000 हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें ।
  2. hydrogel कल्चर में बफर RLT के ३५० µ l को जोड़ें ।
  3. एक 20 जी सुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी का उपयोग करना, टुकड़ा कम से कम 20 बार सुई के माध्यम से पूरे मिश्रण धक्का द्वारा जेल ।
  4. एक homogenizer एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखा कॉलम में पूरे मिश्रण स्थानांतरण । 2 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  5. एक साफ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में supernatant हस्तांतरण । सावधान रहना जेल के नीचे वेग से परेशान करने के लिए नहीं है ।
  6. lysate नमूना १००% इथेनॉल के ३५० µ एल के साथ मिश्रण । एक स्पिन कॉलम (किट से) एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में जगह के लिए सभी नमूने स्थानांतरण । १३,००० x g पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक
  7. पीसीआर के लिए आरएनए शुद्धि के लिए बाद के चरणों के लिए, किट निर्माता द्वारा प्रदान की सामान्य प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    नोट: एक बार आरएनए निकाला है, पीसीआर के लिए मानक प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

thiolated हा के प्रत्येक बैच के लिए, thiolation की डिग्री एच1-एनएमआर या एक Ellman परीक्षण का उपयोग कर सत्यापित किया जाना चाहिए । हा संशोधन प्रक्रिया का उपयोग यहां वर्णित लगातार उत्पंन ~ 5% thiolation (thiols के दाढ़ अनुपात के रूप में परिभाषित करने के लिए हा disaccharides) (चित्रा 1)।

इस नए संस्कृति मंच की स्थापना प्रत्येक प्रयोगशाला कठोर परीक्षण करने के लिए अच्छा संस्कृति व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए बड़े पैमाने पर प्रयोगों को लागू करने से पहले की आवश्यकता होगी । हमारे ८० µ एल hydrogels के साथ एक बीज का घनत्व ५००,००० कोशिकाओं/एमएल (४०,००० कक्ष/) लगातार प्रसार दरों में परिणाम है कि तुलना कर रहे हैं, या से बेहतर, gliomasphere संस्कृतियों (चित्रा 2a-2c)। के रूप में हा/खूंटी hydrogels ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, सेल व्यवहार लाइव, 3 डी संस्कृतियों चरण कंट्रास्ट या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर में सीधे देखा जा सकता है । चित्रा 3 से पता चलता है कि, encapsulation के बाद 4 दिन, RGD-युक्त hydrogels में जीबीएम कोशिकाओं एक इनवेसिव phenotype प्रदर्शन, जबकि hydrogel में प्रसंस्कृत कोशिकाओं खूंटी-मल-CYS नियंत्रण का उपयोग कर एक गोलाकार आकृति विज्ञान है ।

के रूप में xenograft मॉडल के साथ विशिष्ट है जहां शोधकर्ताओं ने महीनों के लिए इंतजार करना होगा जब तक प्रत्यारोपित ट्यूमर प्रगतिशील विकास24,३२तक पहुंच, रोगी व्युत्पंन कोशिकाओं को भी समय लेने के लिए एक नई संस्कृति पर्यावरण को समायोजित करें । इस प्रकार, हम अनुशंसा करते हैं संवर्धन 4-8 दिनों से पहले शुरू प्रयोगों, जैसे नशीली दवाओं के उपचार, सुनिश्चित करने के लिए सबसे अधिक कोशिकाओं के घातीय वृद्धि चरण में प्रवेश किया है. दवा उपचार से परे, घुलनशील cyclo-RGD, जो प्रतिस्पर्धी hydrogels में RGD के साथ सेल बातचीत को बाधित की तरह reagent, संस्कृति माध्यम (3 एआंकड़ा)में जोड़ा जा सकता है ।

हमारे hydrogel प्रणाली तंत्रिकाबंधार्बुद सेल जीवविज्ञान की जांच के लिए कई आम तरीकों के साथ संगत है । bioluminescence इमेजिंग, जो आमतौर पर कुतर xenograft ट्यूमर की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग कर, व्यवहार्य कोशिकाओं के सापेक्ष संख्या उपचार के दौरान hydrogel संस्कृतियों में मनाया जा सकता है । चित्र 3 बी इस पद्धति का एक उदाहरण प्रदान करता है, जहां hydrogel-कल्चर्ड जीबीएम कोशिकाओं पर erlotinib उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन 6 दिनों में किया गया था । सामांय में, hydrogel संस्कृतियों के ऊतकों के नमूनों के रूप में इलाज किया जा सकता है जब पश्चिमी दाग या पीसीआर के लिए lysates की तैयारी । पश्चिमी दाग सट पाली ADP पोलीमरेज़ के विश्लेषण से संकेत मिलता है कि रिश्तेदार की डिग्री apoptosis CD44 पछाड़ना कोशिकाओं में wildtype जीबीएम कोशिकाओं में ०.५% हा hydrogels (आंकड़ा 3सी)में संस्कृति से अधिक है । इसी तरह, एकल कोशिका निलंबन hydrogel संस्कृतियों से प्रवाह के माध्यम से विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता है cytometry बरकरार ऊतकों से मुक्ति एकल कोशिकाओं के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग (चित्रा 2) । सेल सुविधाओं के अलावा, hydrogel के cryosections आधारित, 3 डी संस्कृतियों ECM संस्कृति कोशिकाओं द्वारा जमा की रक्षा । उदाहरण के लिए, hydrogel संस्कृतियों (चित्रा 3 डी)के erlotinib उपचार पर प्रकार चतुर्थ कोलेजन बदलाव की स्थिति पैटर्न ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रतिनिधि ज 1 -thiolated hyaluronic एसिड का एनएमआर स्पेक्ट्रम । एकीकृत चोटियों संकेत मिलता है कि लगभग 5% हा ग्लुकुरोनिक एसिड समूहों के एक thiol के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : hydrogel-encapsulated कोशिकाओं के प्रसार । A) 12-well प्लेट्स में गढ़े ८० µ l जैल की उदाहरण छवियां । crosslinking के बाद hydrogels सेल कल्चरल मीडियम में सूजन आ गई । ख) प्रवाह cytometry का उपयोग करते हुए प्रसार दर मापी के प्रतिनिधि परिणाम. जीबीएम (HK301) 1 µ एम EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) के साथ २.५ घंटे के लिए चौथे दिन encapsulation या passaging के बाद के साथ मशीनी थे । एक क्लिक प्रतिक्रिया को शामिल किया EdU के लिए फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मी, के रूप में जिओ एट अल में विस्तृत प्रयोग किया गया । २०१७.3 नकारात्मक नियंत्रण, जहां कोई EdU संस्कृतियों में जोड़ा गया था, शामिल थे । ग) प्रतिनिधि फोकल माइक्रोस्कोपी लाइव (हरी) और मृत (लाल) कोशिकाओं के 24 घंटे hydrogel संस्कृतियों के बाद जीबीएम कोशिकाओं (HK157) की स्थापना की गई । स्केल बार्स = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : लक्षण वर्णन । क) प्रतिनिधि चरण ०.५% (डब्ल्यू/वी) हा hydrogel के विपरीत छवियों-encapsulation के बाद 8 दिनों के लिए बदलती शर्तों के तहत प्रसंस्कृत कोशिकाओं । तीर एक इनवेसिव आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं का संकेत । ख) bioluminescence संकेत के प्रतिनिधि छवियों 1 µ एम erlotinib या वाहन (DMSO) के साथ इलाज के 15 दिनों के बाद मापा । 1 मिमी D-luciferin को इमेजिंग करने से पहले सेल कल्चर मीडियम 1 ज में जोड़ा गया था । कोशिकाओं lentivirus के गठन के लिए एंकोडिंग के साथ transduced थे जुगनू luciferase से पहले encapsulation के लिए । ग) प्रतिनिधि प्रतिरक्षा-दाग छवियों का विश्लेषण सट पाली ADP पोलीमरेज़ (सीएल-प्प) अभिव्यक्ति में जीबीएम कोशिकाओं (HK301) ०.५% (डब्ल्यू/वी) हा और 1 hydrogels compression केपीए के साथ मापांक में संस्कृति । दिखाए गए सभी फसली चित्र एक ही दाग से थे । घ) कोलेजन IV के दाग (हरा) और Hoechst ३३३४२ (नीला) hydrogel में-cultureed HK301 कोशिकाओं 1 µm erlotinib या वाहन (DMSO) के साथ उपचार के बाद 12 दिन । स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जेल प्रकार भाग ए (४० µ l येक) भाग ब (४० µ l येक)
4Arm-खूंटी-मल (50mg/ Cysteine या RGD ( पंजाबियों (पीएच ७.४) 4Arm-खूंटी-thiol (50mg/ पंजाबियों (पीएच ७.४) हा-S (13.3 mg/
०.५% (w/v) हा 1kPa 10 µ l ४.०० µ l 26 µ l १.०० µ l ९.०० µ l ३०.० µ l
०.५% (w/v) हा 2kPa २०.० µ l ४.०० µ l १६.० µ l ८.०० µ l २.०० µ l ३०.० µ l
०.१% (w/v) हा 1kPa 10 µ l ४.०० µ l 26 µ l ८.०० µ l २६.० µ l ६.०० µ l

तालिका 1. Hydrogel योगों में हा एकाग्रता और यांत्रिक गुणों का स्वतंत्र नियंत्रण उपज है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

reproducible इस 3 डी संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर डेटा की जनरेशन की आवश्यकता है: 1) अनुरूप बैच-to-बैच thiolation of HA, 2) अभ्यास के कुशल मिश्रण प्राप्त करने के लिए hydrogel पुरोगामी और हैंडलिंग hydrogel संस्कृतियों के नुकसान को रोकने के लिए और 3) अनुकूलित सीडिंग प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए घनत्व का इस्तेमाल किया ।

जब हा के एक विशेष वजन प्रतिशत hydrogel में वांछित है, हा के thiolation की डिग्री crosslink घनत्व निर्धारित करता है । हम अनुशंसा करते है कि बैच-से-बैच भिंनता को ंयूनतम करने के लिए प्रत्येक thiolation प्रतिक्रिया के लिए एक सुसंगत मात्रा का उपयोग करें । हमारा सुझाव है कि कम से ३०० मिलीग्राम हा प्रत्येक thiolation प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि thiolated हा के एक ही बैच कई प्रयोगात्मक दोहराने के लिए इस्तेमाल किया जा कर सकते हैं । 4-एआरएम खूंटी पर maleimide समूहों के लिए thiols के दाढ़ अनुपात हमेशा 1.1 होना चाहिए: अधिकतम crosslinking दक्षता सुनिश्चित करने के लिए 1. इस प्रकार, यदि thiolation की डिग्री विविध है, तो खूंटी की राशि-मल जोड़ा तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । जब पेप्टाइड्स जेल गठन करने से पहले maleimides करने के लिए संयुग्मित हैं, सीमित पेप्टाइड्स के साथ खूंटी हथियारों की अनुमानित संख्या इस गणना के लिए उपलब्ध maleimides की कुल संख्या से घटाया जाना चाहिए. इसके अलावा, हम डाइसल्फ़ाइड बांड गठन कि विघटन और लगातार जमाना को रोकने जाएगा से बचने के लिए 10-15% से नीचे हा thiolation की डिग्री रखने की सलाह देते हैं ।

thiol और maleimide समूहों के बीच माइकल-प्रकार के अतिरिक्त प्रतिक्रिया यह सुनिश्चित करता है कि जमाना एक मिनट में होता है । हालांकि इस तेजी से जमाना समय कोशिकाओं की मात्रा को कम करता है hydrogel में निलंबित पुरोगामी पूर्ण माध्यम के बिना कर रहे हैं, जो उनकी व्यवहार्यता समझौता कर सकते हैं, encapsulation प्रक्रिया सभी pipetting और मिश्रण चरणों को प्राप्त करने के साथ अनुभव की आवश्यकता है reproducible परिणाम. आमतौर पर, हम नए प्रशिक्षुओं "असली" encapsulation प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले कोशिकाओं के बिना जमाना के कई दौर अभ्यास किया है ।

प्रतिक्रिया तापमान और प्रणेता पीएच: दो कारकों जमाना गति मिलाना करने के लिए tweaked किया जा सकता है । मिश्रण प्रतिक्रिया धीमा कर देती है और अधिक से अधिक समय के लिए अग्रदूत समाधान मिश्रण करने के लिए प्रदान करता है, जबकि बर्फ पर अच्छी तरह से थाली रखकर प्रतिक्रिया तापमान कम. हालांकि, यह उचित अपूतित तकनीकों का उपयोग कर बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए । इसी तरह, पूर्ववर्ती समाधान के पीएच को बढ़ाने के लिए या उच्च या कम पीएच, क्रमशः का उपयोग करके प्रतिक्रिया समय में कमी परिवर्तित किया जा सकता है । चूंकि thiolated हा अंलीय पानी के खिलाफ dialyzed है डाइसल्फ़ाइड बांड गठन को रोकने के लिए, पुनर्गठन thiolated हा कम पीएच से अंयथा उंमीद की जा सकती है उपज होगी । सामांय में, HBSS बफर में 20 मिमी HEPES में पुनर्गठन, 9 पीएच के लिए समायोजित, 7 के पास एक पीएच उपज होगा जब 15 मिलीग्राम/thiolated हा (~ 5% thiolated) के मिलीलीटर भंग है । हम सुझाव है कि पीएच 6.8-7 thiolated हा समाधान का उपयोग करने की अनुमति भी जेल समाधान के मिश्रण जबकि अधिकतम सेल स्वास्थ्य ।

encapsulation के दौरान घनत्व सीडिंग सेलुलर व्यवहार्यता और प्रयोगात्मक reproducibility के लिए महत्वपूर्ण है । हम १००,००० करने के लिए २,०००,००० कोशिकाओं/एमएल की सीमा में सीडिंग की सिफारिश । हमने पाया है कि इस श्रेणी के सबसे अधिक सेल प्रकार की व्यवहार्यता के लिए इष्टतम है, जबकि अधिक से कम 3 सप्ताह की एक प्रयोगात्मक समय सीमा के भीतर प्रवाह को रोकने । प्रारंभिक सीडिंग घनत्व है कि व्यवहार्यता का अनुकूलन के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए निर्धारित ।

अति सावधानी जब सेल माध्यम बदलने के रूप में इतनी के रूप में हानिकारक hydrogel संस्कृतियों से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । विशेष रूप से, ध्यान रखना पिपेट में hydrogel महाप्राण नहीं है । इस प्रकार, निर्वात आकांक्षा का उपयोग नहीं करते हैं और इसके बजाय एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट मैन्युअल महाप्राण करने के लिए उपयोग. एक समय में अच्छी तरह से एक संस्कृति में केवल आधा माध्यम बदलने से भी मदद मिल सकती है ।

सामांय में, इस तकनीक के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता और निरंतरता प्राप्त अभ्यास की आवश्यकता है । एक बार एक प्रयोगशाला विशेष प्रोटोकॉल की स्थापना की है, 3 डी संस्कृति प्रणाली के लिए सेल संस्कृति और explanted ऊतकों के लिए विशिष्ट रूप में कई लक्षण वर्णन विधियों का उपयोग करने के शोधकर्ता सक्षम बनाता है । यहां, हम विश्लेषण के लिए कई तकनीकों का वर्णन किया है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस सहित, प्रवाह cytometry, पश्चिमी सोख्ता, और bioluminescence जी के इमेजिंग, 3 डी संस्कृतियों (चित्रा 2-3)। लक्षण वर्णन विधियों के अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, कृपया देखें जिओ एट अल. २०१७3. अंत में, के रूप में हा/खूंटी hydrogels ऑप्टिकली पारदर्शी, फोकल इमेजिंग सहित मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक, रहते हैं, 3 डी संस्कृतियों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम के NIH (R21NS093199) और UCLA आर्क 3R's पुरस्कार से धन के साथ समर्थन किया गया था । हमारे sincerest धंयवाद HK301 और HK157 सेल लाइनों के प्रावधान के लिए डॉ हार्ले Kornblum की प्रयोगशाला में जाओ । हम भी ucla ऊतक पैथोलॉजी कोर प्रयोगशाला (TPCL) cryosectioning के लिए धंयवाद, उंनत प्रकाश माइक्रोस्कोपी/स्पेक्ट्रोस्कोपी कोर सुविधा (कैलिफोर्निया Nanosystems संस्थान में भिक्षा) (CNSI) के लिए ucla में फोकल माइक्रोस्कोप, ucla Crump संस्थान के उपयोग के लिए IVIS इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए आण्विक इमेजिंग, ucla आणविक उपकरण केंद्र (MIC) चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदान करने के लिए, और प्रवाह Cytometry कोर में Jonsson व्यापक कैंसर केंद्र (JCCC) UCLA में प्रवाह के लिए उपकरण प्रदान करने के लिए cytometry ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pH meter Thermo Fisher N/A Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity
Stir plate Thermo Fisher N/A General lab equipment
Erlenmeyer flask (125mL) Thermo Fisher FB-501-125
dialysis tubes Thermo Fisher 21-152-14
2L polypropylene beaker Thermo Fisher S01916
sodium hyaluronan Lifecore HA700k-5 500-750 kDa range
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo Fisher PI-22980
N-hydroxysuccinimide (NHS) sigma aldrich 130672-5G
Hydrochloric acid (HCl) Thermo Fisher SA48-500
Sodium hydroxide (NaOH) Thermo Fisher SS266-1
Cystamine dihydrochloride Thermo Fisher AC111770250
Dithiolthreitol (DTT) Thermo Fisher BP172-25
Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid Sigma Aldrich D218200-1G
Deuterated water (deuterium oxide) Thermo Fisher AC166301000
0.22µm vacuum driven filter CellTreat 229706
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher P32080-100T
Hanks' balanced salt saline (HBSS) Thermo Fisher MT-21-022-CV
4-arm-PEG-maleimide JenKem Technology A7029-1 molecular weight around 20kDa
4-arm-PEG-thiol JenKem Technology A7039-1 molecular weight around 20kDa
L-Cysteine  sigma aldrich C7880-100G
RGD ECM mimetic peptide Genscript Biotech N/A Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated
silicone molds Sigma Aldrich GBL664201-25EA Use razor blade to cut into single pieces
complete culture medium Various Various DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs
patient derived GBM cell N/A N/A
20G needle BD medical 305175
1mL syringe Thermo Fisher 14-823-434
10mL syringe BD medical 302995
RIPA Buffer Thermo Fisher PI-89901
protease/phosphatase inhibitor mini tablet sigma aldrich 5892970001
vortex shaker Thermo Fisher 12-814-5Q
TrypLE express Thermo Fisher 12604013
70µm cell strainer Thermo Fisher 22-363-548
Paraformaldehyde Thermo Fisher AC416785000 Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4
D-sucrose Thermo Fisher BP220-1
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Thermo Fisher NC9373881
Cell culture incubator Thermo Fisher N/A Any General One with 5% CO2 and 37C
fridge/freezer Thermo Fisher N/A Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity
Disposable embedding molds Thermo Fisher 12-20
Lyapholizer Labconco N/A Any -105C freeze dryers
HEPES Thermo Fisher BP310-500
Amber vial Kimble Chase 60912D-2
Wide orifice pipette tips Thermo Fisher 9405120
2-methylbutane Thermo Fisher 03551-4
Dry Ice N/A N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
  2. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  3. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  4. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  5. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
  6. Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
  7. Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
  8. Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
  9. Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. Role of hyaluronan in glioma invasion. Cell adhesion & migration. 2 (3), 202-207 (2008).
  10. Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
  11. Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
  12. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  13. Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
  14. Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
  15. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
  16. Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
  17. Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
  18. Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
  19. Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
  20. Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
  21. Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
  23. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  24. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  25. Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
  26. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  27. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  28. Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
  29. Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
  30. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
  31. Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
  32. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).

Tags

इंजीनियरिंग १३८ अंक Hyaluronic एसिड 3 डी संस्कृति ग्लियोब्लास्टोमा microenvironment extracellular मैट्रिक्स सामग्री mechanobiology दवा प्रतिरोध
रोगी-व्युत्पंन ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के 3-आयामी संस्कृति के लिए Hyaluronic-एसिड आधारित Hydrogels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi,… More

Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells. J. Vis. Exp. (138), e58176, doi:10.3791/58176 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter