Очистка низким обильные клеток в зрительной системе дрозофилы
Summary
Здесь мы представляем протокол диссоциации клеток для эффективно изолировать клетки присутствуют в низкой изобилия в пределах дрозофилы зрительной системы через клеток активированных флуоресцированием сортируя (FACS).
Abstract
Недавние улучшения в чувствительности следующего поколения секвенирования облегчили применения геномного анализа и транскриптомики для небольшого числа клеток. Использования этой технологии для изучения развития в зрительной системе дрозофилы, который может похвастаться богатством клеток генетического типа инструменты, обеспечивает мощный подход для решения молекулярные основы развития с точным сотовой резолюции. Для такого подхода к возможно важно иметь возможность надежно и эффективно очищает клетки присутствуют в низкой изобилия в головном мозге. Здесь мы представляем метод, который позволяет эффективное очищение одной ячейки клонов в мозаика генетических экспериментов. Этот протокол мы последовательно достичь Высокодоходные клеточной после очистки с помощью флуоресценции активации клеток, сортируя (FACS) (~ 25% всех помеченных клеток) и успешно выполняется анализ transcriptomics на одну ячейку клоны, созданные через Мозаика анализ с маркером repressible клеток (MARCM). Этот протокол является идеальным для применения транскриптомики и геномный анализ типов определенных ячеек в зрительной системе, на различных стадиях развития и в контексте различных генетических манипуляций.
Introduction
Зрительная система дрозофилы является выдающаяся модель для изучения генетической основы развития и поведения. Она включает стереотипных сотовой архитектуры1 и передовых генетических инструментарий для манипулирования клеток конкретных типов2,3. Одним из основных преимуществ этой системы заключается в возможности самостоятельно допросить функции гена в типах клеток интерес с резолюцией одной ячейки, используя генетический мозаика методы4,5. Мы стремились объединить эти генетические инструменты с последних достижений в следующего поколения последовательности для выполнения определенного типа клеток транскриптомики и геномный анализ в одну ячейку клоны в мозаика генетических экспериментов.
Для этого важно разработать надежный и эффективный способ выборочно изолировать низкой обильные клеточных популяций в головном мозге. Ранее мы разработали протокол для изоляции типы конкретных клеток в зрительной системе во время куколки разработки через СУИМ и определение их transcriptomes с помощью РНК seq6. В этих экспериментах подавляющее большинство клеток определенного типа (например , R7 фоторецепторов) дневно были помечены. С помощью этого метода, в генетических мозаика экспериментов, в котором обозначены только подмножество ячеек того же типа, мы смогли выделить достаточное количество клеток для получения качественных данных последовательности. Для решения этой проблемы, мы стремились увеличить сотовой урожайности путем улучшения протокол диссоциации клеток.
Наш подход был снизить Общая длина протокола повысить здоровье диссоциированных клеток, улучшить здоровье клеток, изменяя диссекции и диссоциации буферов, и уменьшить количество механического разрушения Иссеченную ткань. Мы протестировали улучшение протокола7 с помощью анализа мозаика с repressible клеток маркер5 (MARCM), который позволяет поколение сингл дневно помечены клоны типов конкретных клеток, которые дикого типа или мутантный ген интереса к в противном случае гетерозиготных летать. Где в одинаковых условиях, наши ранее протокол удалось создать достаточно материала для РНК seq, улучшение протокол был успешным. Мы можно воспроизвести достичь Высокодоходные клеточной (~ 25% помеченных клеток) и получить высокое качество РНК seq данных как 1000 ячеек7.
Ряд протоколов были ранее описаны изолировать типы клеток конкретного дрозофилы6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. Эти протоколы предназначены главным образом для изоляции клетки, которые изобилуют в головном мозге. Наш протокол оптимизирован для изоляции низких обильные клеточных популяций (менее 100 ячеек на мозг) в зрительной системе с помощью СУИМ для последующего транскриптомики и геномного анализа. Этот протокол мы стремимся обеспечить для герметизации изоляции низких обильные клетки от летать зрительной системы СУИМ и получение высококачественных данных транскриптом РНК-далее
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол является простой и технически не сложно выполнять, но есть несколько ключевых шагов, если игнорировать волю вызывает значительное сокращение в клеточных урожайности. (Шаг 2.3.2.) Важно, что кресты являются здоровыми, и что еда не высыхает. Регулярный полив кресты важно макси?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось NINDS национальных институтов здравоохранения под номером премии K01NS094545, andgrants от центра Лефлер для изучения нейродегенеративных расстройств. Мы признаем известкования Тан и Джейсон МакЭван для ценных разговоров.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
