Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die menschlichen Dental Pulp Stammzellen isoliert und Vermehrung um das Prion-Protein-Expression bei neuronalen Differenzierungsprozess zu bewerten.
Abstract
Bioethische Fragen im Zusammenhang mit der Manipulation von embryonalen Stammzellen haben Fortschritte auf dem Gebiet der medizinischen Forschung behindert. Aus diesem Grund ist es sehr wichtig, adulten Stammzellen aus verschiedenen Geweben wie Fettgewebe, Nabelschnurblut, Knochenmark und Blut zu erhalten. Zu den möglichen Quellen ist Zahnpulpa besonders interessant, weil es einfach ist, in Bezug auf bioethische Aspekte zu erhalten. In der Tat Dental Pulp Stammzellen (hDPSCs) sind eine Art von adulten Stammzellen in neuronalen-ähnliche Zellen zu unterscheiden und kann der dritte Molar von gesunden Patienten (im Alter von 13-19) entnommen werden. Insbesondere wurde die Pulpa entfernt mit einem Bagger, in kleine Scheiben schneiden, mit Kollagenase IV behandelt und kultiviert in einem Kolben. Um die neuronale Differenzierung zu induzieren, wurden hDPSCs für 2 Wochen mit EGF/bFGF stimuliert. Bisher haben wir gezeigt, dass bei der Differenzierung der Gehalt an zellulären Prion Protein (PrPC) in hDPSCs erhöht. Die Cytofluorimetric Analyse zeigte frühen Ausdruck der PrPC , die nach neuronalen Differenzierungsprozess erhöht. Ablation von PrPC von SiRNA verhindert PrP neuronaler Differenzierung induziert durch EGF/bFGF. In diesem Beitrag zeigen wir, dass wir verstärkte Isolation, Trennung und in-vitro- Kultivierung Methoden der hDPSCs mit einige einfache Verfahren, effizientere Zellklonen erhaltenen und groß angelegte Erweiterung der mesenchymalen Stammzellen (MSCs) waren wurde beobachtet. Wir zeigen auch, wie die hDPSCs, mit Methoden, die gemäß des Protokolls erhalten sind ein ausgezeichnetes experimentelles Modell neuronaler Differenzierung der MSCs und anschließende zelluläre und molekulare Prozesse zu studieren.
Introduction
Mesenchymaler Stammzellen wurden isoliert aus verschiedenen Geweben, einschließlich Knochenmark, Nabelschnurblut, menschliche Zahnpulpa, Fettgewebe und Blut1,2,3,4,5 , 6. wie von mehreren Autoren berichtet, zeigen hDPSCs Kunststoff festhalten, eine typische Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Diese stellen eine sehr heterogene Bevölkerung mit verschiedenen Klonen und Unterschiede in der proliferativen und differenzierenden Kapazität7,8. hDPSCs express spezifischer Marker für mesenchymale Stammzellen (d.h. CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), sie sind negativ für einige hämatopoetischen Marker (z. B. CD14 und CD19) und sind in der Lage, in-vitro-multilineage Differenzierung9, 10,11.
Mehrere Autoren haben gezeigt, dass diese Zellen in der Lage sind zu differenzieren in Neuron-wie Zellen mit verschiedenen Protokollen, die den Zusatz von NGF, bFGF, EGF in Kombination mit den spezifischen Medien und Ergänzungen7,-12enthalten. Auch viele Proteine während neuronaler Differenzierungsprozess beteiligt sind, und unter diesen sind mehrere Papiere zeigen eine wichtige Rolle und Ausdruck des zellulären Prion-Proteins (PrPC), beide in embryonalen und adulten Stammzellen13, 14. PrPC stellt einen pleiotropen Molekül in der Lage verschiedene Funktionen innerhalb der Zellen als Kupfermetabolismus, Apoptose, und Widerstand gegen oxidativen stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
In unseren bisherigen Papier23untersuchten wir die Rolle von PrPC in den hDPSCs neuronalen Differenzierungsprozess. In der Tat hDPSCs express altklug PrPC und nach neuronaler Differenzierung war es möglich, eine zusätzliche Erhöhung zu beobachten. Andere Autoren die Hypothese auf einer möglichen Rolle von PrPC in neuronale Differenzierungsprozesse von Stammzellen. In der Tat treibt PrPC die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen in Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten24. Der Zweck dieser Studie war, die Methodik für die Gewinnung von Stammzellen aus Zahnpulpa, seine Differenzierungsprozess und die Rolle der PrPC während neuronaler Differenzierung zu betonen.
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Protocol
Dritte Molaren, die in der Studie verwendet wurden von Patienten (13-19 Jahre alt) mit keine vorherige Erfahrung im Bereich der Drogen- oder Alkoholkonsum, alle Nichtraucher-Zimmer und mit geeigneten Mundhygiene herausgeschnitten. Am Tag der Erklärung an die Abteilung Wissenschaft Zahnheilkunde und Kieferchirurgie der Universität Rom "La Sapienza" wurde von den Patienten oder die Eltern Einwilligung eingeholt. Die Einwilligung wurde basierend auf ethischen Überlegungen und Zustimmung der Ethik-Kommission.
1. Zahn und Zahnpulpa Extraktion
-
Vorbereitung des entsprechenden Mediums für die Erhaltung oder Transport.
- Dulbeccos geändert Eagle mittlere niedrigen Konzentration von Glukose (DMEM-L) mit L-Glutamin (494,5 mL) vorzubereiten.
- Geben Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %) und 0,5 mL Amphotericin (0,1 %).
- Der dritte Molar vom Patienten zu extrahieren, schnell spülen Sie ihn mit PBS, legen Sie in einem 15 mL Reagenzglas mit dem Medium und überträgt es auf das Labor in weniger als 2 h.
- Öffnen Sie unter der Haube ein Biohazard den Zahn mit einem Cutter von koronalen Schnittlaufs parallel und tangential durch das Dach der Pulpakammer.
- Vorsichtig entfernen Sie, das Fruchtfleisch mit einem kleinen Bagger und legen Sie sie in ein Reagenzglas.
- Dreimal mit PBS waschen und Zentrifugieren bei 2.500 X g für 10 min bei RT
2. Verarbeitung der Pulpa und Stammzell-Release
- Entfernen des Überstands, Aufschwemmen das Pellet in Hanks Lösung und legen Sie sie in eine Petrischale. 2 h bei 37 ° C in 5 % CO2inkubieren.
-
Typ IV Kollagenase Vorbereitung der Lösung.
- Bereiten Sie 0,8 mL DMEM-L.
- Schmelzen Sie 1 mg Typ IV Kollagenase in 0,8 mL DMEM-L und Vortex für mehrere Minuten.
- Fügen Sie DMEM-L bis zu 1 mL, eine Endkonzentration haben 1 mg/mL.
- Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 µM-Filter.
- Hank es Lösung durch Zentrifugation bei 2.500 X g für 10 min bei RT entfernen und dem Fruchtfleisch in kleine Scheiben ca. 1 mm jeweils mit einem Einweg Skalpell unterteilen.
- Legen Sie die Zellstoff-Scheiben in einer Petrischale und inkubieren Sie mit 1 mL Typ IV Kollagenase für 15 min bei 37 ° C in 5 % CO2.
-
Mittlere Kultur Vorbereitung (500 mL).
- Auf 445 mL DMEM-L mit L-Glutamin.
- Fügen Sie 50 mL der fetalen Bovine Serum (FBS) (10 %).
- Fügen Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %).
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.500 X g für 10 min bei RT, entfernen des Überstands, Aufschwemmen das Pellet in das Medium (Schritt 2.5) und Kultur in T25 Kolben speziell für Stammzellen bei 37 ° C in 5 % CO2.
(3) Stammzelle-Kultur und Vermehrung
- Jeden Tag überprüfen Sie die Kultur und nach 3 Tagen des Wachstums beobachten Sie verschiedene Klone von adhärenten Zellen innerhalb der Flasche.
- Alle 3 Tage ändern das Kulturmedium.
- Zwischen 7 und 12 Tagen sobald die adhärenten Zellen erreichen Zusammenfluss haben, lösen sie durch Behandlung der Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft mit einem Zelle Schaber.
- Fügen Sie 4 ml (Verhältnis 1:5) des Kulturmediums (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 6 min bei 259 X g, entfernen Sie überstand zu und legen Sie die Zellen in einem T25 Kolben zu propagieren.
Hinweis: Alle 3 Tage erreichen die Zellen Zusammenfluss. - Verbreiten Sie die Zellen bis zu 21 oder 28 Tage (ca. 6-8 Gänge), das Vorhandensein von nicht-Stamm wie Zellen in der Kultur zu vermeiden.
- Lösen Sie die Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft kratzen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 6 min bei 259 X g.
- Entfernen Sie den Überstand zu und testen Sie die Zellen für die Cytofluorimetric Analyse (Schritt 6).
(4) vorübergehende PrPC Silencing durch siRNA
- Kultur der hDPSCsin-6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5) für 24 h.
-
Am darauffolgenden Tag bereiten SiRNA PrP Medium (400 µL).
- Hinzufügen einer sterilen Reagenzglas 384 µL DMEM-L.
- 1 µL für jede Art von SiRNA PrP hinzufügen DMEM-L haben eine Endkonzentration von 5 nM (4 SiRNA PrP verwendet wurden und verifiziert durch den Lieferanten garantieren eine Knockdown Effizienz ≥70 %).
- DMEM-L. 12 µL Transfectionreagent hinzufügen
- Wirbel der Mischung und 10 min bei RT ermöglicht die Bildung von komplexen Transfektion inkubieren.
- Jede Probe 400 μl SiRNA PrP Medium hinzu und 6 h bei 37 ° c inkubieren
- Fügen Sie ohne SiRNA PrP Medium zu verwerfen, 1,6 mL Kulturmedium (Schritt 2.5) (Verhältnis von 1 bis 5).
- Lassen Sie die Zellen für 72 h bei 37 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand zu und waschen Sie 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT
- Fügen Sie 2 mL der neuronalen Kulturmedium für 7 bzw. 14 Tage (Schritt 5.1).
- Ändern der neuronalen Kulturmediums alle 3 Tage.
Hinweis: Ersetzen Sie der SiRNA PrP Lösung jeder Zeit ersetzen die neuronalen Kulturmedium. - Am Ende der Zeit 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT waschen und testen für neuronale Oberflächenantigenen von Western-Blot Analyse.
(5) neuronale Einführungsprozess des hDPSCs
-
Neuronale Kulturmedium Vorbereitung (500 mL).
- Bereiten Sie 444,7 mL basale Medien formuliert, um neuronale Zellen.
- Das Medium fügen Sie 50 mL serumfreien Ergänzung zur Unterstützung der langfristigen Rentabilität des embryonalen und adulten neuronalen Stammzellen (10 %) eingesetzt hinzu.
- Das Medium (Endkonzentration 20 ng/mL) 200 µL des basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (Endkonzentration 40 ng/mL) und 100 µL der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) hinzufügen.
- Geben Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %) auf das Medium.
- Kultur hDPSCs in 6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) bis zu 28 Tage von der Zellstoff-Trennung und mit 2 mL der neuronalen Kulturmedium zu stimulieren.
- Alle 3 Tage überstand verwerfen, 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT waschen und 2 mL der neuronalen Kulturmedium zu ersetzen.
- Lösen Sie nach 7 bzw. 14 Tage die Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder vorsichtig mit einem Schaber.
- Fügen Sie 4 mL (Verhältnis 1:5) Kulturmedium (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen.
- Test für das Vorhandensein von neuronalen Oberflächenantigenen (Schritt 6) oder die Prion-Protein-Expression (Schritt 7) durch Flow-Zytometrie-Analyse.
6. Charakterisierung der hDPSCs von Flow Cytometry
- Wählen Sie mesenchymaler Stromazellen (MSC)-spezifische oder neuronale Oberflächenantigenen.
- Kultur der hDPSCs in 6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5).
- Lösen Sie hDPSCs mit 28 Tagen von der Zahnpulpa Trennung oder nach 14 Tagen der neuronalen Kulturmedium (Schritt 5.1) mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft Schaber.
- 4 ml (Verhältnis 1:5) Kulturmedium (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen und entmischen bei 259 X g für 6 min bei RT Waschen ein anderes 2 Mal mit 2 mL PBS bei RT
- Befestigen Sie die behandelten oder unbehandelten hDPSCs mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei 4 ° c
- Permeabilize hDPSCS mit 0,1 % (V/V) nichtionisches Tensid mit PBS-Puffer für zusätzliche 10 min bei RT
- Führen Sie die Sperrung mit 5 % getrockneten Magermilch in 1 mL PBS für 1 h bei RT
- 3 Mal mit 1 mL PBS waschen und inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), anti-β3-Tubulin (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 Zellen) und Anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 Zellen) mAb für 1 h bei RT
- Die Zellen 3 Mal mit 1 mL PBS waschen und inkubieren Sie mit Anti-Maus-PE (01:50 / 5 x 105 Zellen) oder Anti-Kaninchen-CY5 (01:50 / 5 x 105 Zellen) mAb für zusätzliche 1 h bei RT
- Verwenden Sie die sekundäre Antikörper für gating Immunopositive Zellen (Anti-Maus-PE oder Anti-Kaninchen-CY5-mAb) und analysieren Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer und erwerben Sie mindestens 20.000 Veranstaltungen.
7. Bewertung der PrPC Ausdruck in hDPSCs von Flow Cytometry Analysis
- Kultur der hDPSCsin-6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5).
- Lösen Sie hDPSCs mit 21 und 28 Tagen Zahnpulpa Trennung und nach 7 bzw. 14 Tage mit neuronalen Kulturmedium (Schritt 5.1) mit 1 mL Trypsin-EDTA zu und stoppen Sie die Trypsin-Aktion zu, wie unter Punkt 6.4 beschrieben. Befestigen Sie die Exemplare mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei 4 ° C.
- Permeabilize mit 0,1 % (V/V) nichtionischen Surfactantin PBS für 10 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen mit Kaninchen Anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 Zellen) Flecken mAb für 1 h bei RT inkubieren mit Anti-Kaninchen CY5 (01:50 / 5 x 105 Zellen) mAb für zusätzliche 1 h bei RT
- Alle Proben mit einem Durchflusszytometer analysiert und mindestens 20.000 Veranstaltungen zu erwerben.
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Representative Results
Die Isolierung und Trennung Verfahren des hDPSCs von Zahnpulpa, gewonnen aus der dritte Molar sind komplexe Prozesse, in denen kleine Veränderungen ein ruinöse Ergebnis führen kann. In diesem Papier verwenden wir das Protokoll des Arthur Et Al. 12 mit einigen Verbesserungen. Eine repräsentative Regelung der Verfahren ist in Abbildung 1dargestellt.
hDPSCs stellt eine heterogene Bevölkerung der Zellen mit verschiedenen Klonen und Unterschiede in der proliferativen und differenzierenden Kapazität7,8. Nach der Trennung der Zellstoff und Aussaat der winzige Fragmente von Zellstoff beobachteten wir Gruppen von Zellen an der Peripherie erweitert. Abbildung 2 zeigt eine kleine Ansammlung von Zellen an 1 Tag (linken), 4 (Mitteltafel) und 7 Tage (rechte Abbildung) von der Zahnpulpa Trennung. In der Regel wachsen diese Cluster von Zellen bis zu der Mündung etwa zwischen 7 und 12 Tagen zu erreichen.
Diese Zellen nach neuronaler Differenzierung induziert durch EGF/bFGF, reduzieren ihr Wachstum, und nach zwei Wochen war es möglich, wesentliche Veränderungen in der Zelle Morphologie und Neuriten Auswuchs (Abbildung 3) zu beobachten.
In Abbildung 4zeigen wir, dass unbehandelte hDPSCs multipotente mesenchymale Stromazellen spezifische Oberflächenantigenen wie CD44, CD90, CD105, CD73 und STRO-15,9ausdrücken. Ansonsten nach entsprechenden neuronalen Induktion Reize express hDPSCs spezifische neuronale Marker wie β3-Tubulin, NFH und GAP43. hDPSCs, unbehandelt oder behandelt mit neuronalen Induktion Reize, drücken nicht aus hämatopoetischen Marker wie CD14 und CD19.
In Abbildung 5zeigen wir, dass hDPSCs altklug PrPC (21 und 28 Tage Express) und nach neuronalen Differenzierungsprozess induziert durch EGF/bFGF für weitere 7 bis 14 Tage, die PrPC Inhalt erhöht (Abb. 5A). Da mehrere Autoren berichteten, dass die neuronale Zelldifferenzierung PrPC beteiligt ist, haben wir die Rolle des endogenen PrPC in diesem Prozess ausgewertet. Daher wurde eine kleine interferierende RNA (SiRNA PrP) angewandt, um PrPC und seine Funktion abtragen. Vorbehandlung mit SiRNA 72 h vor dem EGF/bFGF Reize für 14 Tage verhindert, dass den Ausdruck der neuronalen Marker B3-Tubulin und wurde (Abb. 5B). Die Daten zeigen, dass Schweigen der PrPC von SiRNA der neuronalen Differenzierungsprozess von hDPSCs, induziert durch EGF/bFGF nach 2 Wochen betroffen.
Abbildung 1 : Regelung der Zahnpulpa Trennung von der dritte Molar. Der Zahn mit einem Cutter von koronalen Schnittlaufs parallel und tangential durch das Dach der Pulpahöhle geöffnet wurde und das Fruchtfleisch war sanft unter sterilen Bedingungen mit einem kleinen Bagger entfernt und in einem Reagenzglas. Das Fruchtfleisch, Hank es Lösung Nachbehandlung war in Scheiben schneiden und mit Kollagenase IV für 15 min behandelt und in ein Auffanggefäß T25 propagiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : hDPSCs Morphologie an verschiedenen Tagen von der Zahnpulpa Trennung von Phase Kontrast Mikroskop. Morphologie der hDPSCs aus Zahnpulpa an verschiedenen Tagen (1, 4, 7) von der Zahnpulpa Trennung. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Neurit Auswuchs des hDPSCs von Phase Kontrast Mikroskop. Morphologie der hDPSCs von dental pulp unbehandelt oder behandelt mit EGF/bFGF für 14 Tage. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Charakterisierung der hDPSCs. Flow Cytometry Analyse von CD44, CD90, CD105, CD73, STRO-1, CD14, CD19, β3-Tubulin, NFH und GAP43 Ausdruck in hDPSCs unbehandelt oder mit EGF/bFGF für 14 Tage behandelt. Histogramme stellen Log Fluoreszenz Vs Zellzahl, gated auf Zell-Population der einen Seite Scatter/Forward Scatter (SS/FS) Histogramm. Jede Platte wurde mit der entsprechenden sekundären Antikörper als Negativkontrolle verglichen. Eine repräsentativere Experiment unter 3 wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Rolle der PrPC während neuronaler Differenzierung der hDSPCs. (A) Cytofluorimetric Analyse der PrPC Ausdruck unbehandelt (21 und 28 Tage von der Zahnpulpa Trennung) und nach weiteren 7 bis 14 Tagen mit neuronalen Induktion Medien EGF/bFGF. Jede Platte wurde mit der entsprechenden IgG negativ Isotype Kontrolle verglichen. Eine repräsentativere Experiment unter 3 wird angezeigt. (B) Western-Blot Analyse der neuronalen Marker β3-Tubulin und NFH Ausdruck (28 Tage von der Zahnpulpa Trennung) und nach weiteren 14 Tagen mit neuronalen Induktion Medien EGF/bFGF in das Vorhandensein oder Fehlen von SiRNA PrP. Diese Zahl 5 (A, B) wurde vom "Role of Prion Protein EGFR multimolecular Komplex während neuronaler Differenzierung der menschlichen dental Pulp-Stammzellen" 23. geändert Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dabei konzentrierten wir uns auf Methoden zur Isolierung und neuronale Differenzierung der hDPSCs; Darüber hinaus haben wir die Rolle des PrPC in diesem Prozess ausgewertet. Es gibt verschiedene Methoden, zu isolieren und hDPSCs in Neuron-wie Zellen und kritischen Schritte während des Prozesses zu unterscheiden. hDPSCs sind in der Lage, mehrere Linien wie Neuronen, Chondroblasten, Adipozyten und Osteoblasten differenzieren. In unserem Paper untersuchten wir die Mechanismen der neuronale Differenzierung und das Vorhandensein von PrPC. Wie oben besprochen, drücken diese Zellen typischen mesenchymale Stromazellen-spezifische Oberflächenantigenen wie CD44, CD90, CD105, CD73 und STRO-110,25,26.
Im Protokoll können mehrere wichtige Schritte dazu führen, dass das Scheitern des Verfahrens Trennung. Der erste wichtige Schritt wird durch die Wahl des Patienten27dargestellt. Nach unserer Erfahrung finden wir das zunehmende Alter der Spender (> 20) allmählich verringert die Fähigkeit der Proliferation und Differenzierung von Stammzellen. In unseren Experimenten haben wir Dritte Molaren herausgeschnitten von Patienten im Alter von 13-19 Jahre alt und keine vorherige Erfahrung im Bereich der Drogen- oder Alkoholkonsum, alle Nichtraucher-Zimmer und mit geeigneten Mundhygiene verwendet.
Der zweite wichtige Schritt wird dargestellt durch die Wahl des Enzyms, die Zellen von das Pulpagewebe zu trennen die wichtigsten hot Schritt von Stammzellen Trennung Verfahren darstellen könnten. In der Tat wurde uns klar, dass eine breite Nutzung Kollagenase I und II, Enzyme, die zu aggressiv sein kann Beschädigung der Zellen in das Pulpagewebe während des Trennung Prozesses. Aus diesem Grund haben wir beschlossen, Kollagenase IV zu verwenden, weil diese Art von Kollagenase als untere tryptic Tätigkeit als Kollagenase Typ I und II. Nach genau dem Verfahren ist es möglich, Stammzellen in 90 % der behandelten Zähne zu erhalten.
Nach der Trennung ist die Lösung mit hDPSCs in entsprechende Flaschen bis zum Eigentumsübergang 6° (ca. 21-28 Tage) auf das Vorhandensein von nicht-Stammzellen in der Kultur zu vermeiden kultiviert. Sie waren mit 28 Tagen auf das Vorhandensein von typischen mesenchymalen Antigene (wie oben verwiesen) getestet und für Experimente verwendet werden, nur dann, wenn sie positiv waren. In der Tat, trotz der erzielten Fortschritte im Laufe der Jahre auf hDPSCs gibt es noch wichtige Einschränkungen durch die extreme Heterogenität der Bevölkerung vertreten.
Wie von mehreren Autoren gezeigt, gibt es verschiedene Zelltypen Bevölkerung in die Pulpa und bisher hat es unbekannt, was die beste Phänotypen, die in der Lage ist, in jeder mesenchymaler Herkunft (Chondroblasten, Fettzellen, Osteoblasten oder Neuronen) zu unterscheiden. Um die aktuellen Einschränkungen unserer und anderer Verfahren zu vermeiden, wird der nächste Schritt sein, zellulare Bevölkerungen mit bestimmten Phänotypen mit spezifischen monoklonalen Antikörpern auszuwählen.
In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass PrPC aus hDPSCs zum Ausdruck kommt. In der Tat ist es möglich, eine schwache Positivität in 21 Tagen und eine Zunahme der PrPC Inhalt von 28 Tagen zu beobachten. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass während der EGF/bFGF-vermittelte neuronale Induktion, PrPC Inhalt weiter erhöht wurde. Darüber hinaus untersuchten wir die Rolle des endogenen PrPC in neuronalen Einführungsprozess des hDPSCs. Die vorübergehende Inaktivierung von PrPC verhindert den Differenzierungsprozess von hDPSCs induziert durch EGF/bFGF23.
Wir verfeinert und verbessert die Methoden der Isolation, der Trennung und der in-vitro-Kultivierung von hDPSCs mit einfache und vielseitige Verfahren. Diese Innovationen ermöglichen eine effizientere Zellklonen und die umfangreiche Erweiterung der mesenchymalen Stammzellen zu erhalten. Darüber hinaus empfehlen wir, dass die hDPSCs ein ausgezeichnetes experimentelles Modell, zelluläre und molekulare Mechanismen der neuronalen Differenzierungsprozess MSCs zu studieren sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der "Fondazione Varrone" und Rieti Universität Hub "Sabina Universitas" zu Vincenzo Mattei unterstützt.
Abbildung 5 (A, B) abgedruckt mit freundlicher Genehmigung des Verlags Taylor & Francis Ltd aus: Rolle des Prion-Protein-EGFR multimolecular Komplex während neuronaler Differenzierung der menschlichen dental Pulp-Stammzellen. Martellucci, S., Manganelli V. C. Santacroce, Santilli F., Piccoli L., M. Sorice Mattei V. Prion. 2018 4 Mar. Taylor & Francis Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
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