Summary
여기 우리는 프리온 단백질 표정 신경 분화 과정을 평가 하기 위해 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 분리 및 전파에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
Bioethical 문제점 배아 줄기 세포의 조작에 관련 된 의료 연구의 분야에서 발전을 방해 있다. 이러한 이유로, 혈액, 골 수, 탯 줄, 지방 같은 다른 조직에서 성체 줄기 세포를 얻기 위해 매우 중요 하다. 가능한 소스 중 치과 펄프 이므로 특히 흥미로운 bioethical 고려 사항에 대 한 얻을 쉽습니다. 실제로, 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSCs) 같은 신경 세포에서 분화 할 수 성인 줄기 세포의 종류와 건강 한 환자 (13-19 세)의 세 번째 어 금 니에서 얻어질 수 있다. 특히, 치과 펄프 굴 삭 기 제거, 작은 조각으로 잘라, 콜라 4로 치료 되었고 플라스 크에서 경작. 신경 감 별 법을 유도, hDPSCs는 2 주 동안 EGF/bFGF와 자극 했다. 이전에 우리는 분화 과정에서 세포 프리온의 내용을 hDPSCs에서 단백질 (PrPC) 증가 증명 하고있다. Cytofluorimetric 분석 PrPC 신경 감 별 법 과정 후 증가의 초기 표현을 했다. SiRNA로 PrPC 의 절제 PrP EGF/bFGF에 의해 유도 된 신경 감 별 법을 방지. 이 문서에 우리 우리 향상 격리, 분리 및 여러 쉬운 절차를 가진 hDPSCs의 재배 방법을 생체 외에서 보다 효율적인 세포 클론 했다 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)의 획득 및 대규모 확장 설명 관찰 되었다. 우리는 또한 어떻게는 프로토콜에 대 한 자세한 방법으로 얻은 hDPSCs는 MSCs의 신경 분화 과정과 후속 세포질과 분자 과정을 공부 하는 우수한 실험 모델을 보여줍니다.
Introduction
중간 엽 줄기 세포는 골 수, 탯 줄 혈액, 인간의 치과 펄프, 지방 조직, 그리고 혈액1,2,3,,45 를 포함 하 여 여러 조직에서 고립 되어 있다 , 6. 여러 저자에 의해 보고, hDPSCs 표시 플라스틱 준수, 전형적인 구와 같은 형태학. 이러한 개별 복제와 증식 및 차별화 용량7,8차이 매우 이질적인 인구를 나타냅니다. hDPSCs 익스프레스 중간 엽 줄기 세포 (CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1)에 대 한 특정 마커, 그들은 일부 조 혈 마커 (CD14 CD19 등)에 대 한 부정적인 고 생체 외에서 multilineage 차별화9, 의 10,11.
몇몇 저자가이 세포는 NGF, bFGF, 특정 미디어 및 보충7,12와 함께에서 EGF의 추가 포함 하는 다른 프로토콜을 사용 하 여 같은 신경 세포로 분화 할 수 나타났습니다. 또한, 많은 단백질 신경 분화 과정에 참여 하 고,이 중, 여러 논문 표시 모두 배아와 성체 줄기 세포13, 관련 역할 및 세포 프리온 단백질 (PrPC)의 중요 한 표현 14. PrPC 나타냅니다 구리 물질 대사, apoptosis로 셀 안에 서로 다른 기능을 수행할 수 있는 다 면 발현 성 분자 그리고 저항을 산화 스트레스15,,1617 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
우리의 이전 종이23, 우리는 PrPC hDPSCs 신경 분화 과정에서의 역할을 조사. 사실, hDPSCs 익스프레스 PrPC 조 하 고, 신경 감 별 법 후 추가 증가 관찰 하는 것이 가능 했다. 다른 저자는 PrPC 줄기 세포의 신경 분화 과정에서의 가능한 역할을 가정 했다. 실제로, PrPC 신경, oligodendrocytes, 및 이다24에 인간 배아 줄기 세포의 분화를 드라이브. 이 연구의 목적은 신경 감 별 법 동안 치과 펄프, 그것의 분화 과정과 PrPC 의 역할에서 줄기 세포를 얻기 위한 방법론을 강조 했다.
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Protocol
연구에 사용 하는 세 번째 어 금 니 환자 (13-19 세)의 약물 또는 알코올 소비 이전 역사 없이, 모든 비 흡연와 적절 한 구강 위생에서에서 excised 했다. 설명 과학 치과와 로마의 "역사적인" 대학 Maxillofacial 당일 동의 환자 또는 부모에서 얻은 했다. 동의 윤리적 고려 사항 및 윤리 위원회의 승인에 따라 얻은 했다.
1. 치아 및 치과 펄프 추출
-
보존 또는 교통에 대 한 적절 한 매체의 준비.
- L-글루타민 (494.5 mL)와 포도 당 (DMEM-L)의 Dulbecco의 수정이 글의 중간 낮은 농도 준비 합니다.
- 페니실린/스 (1%)의 5 mL을 추가 고 암포 (0.1%)의 0.5 mL.
- 환자에서 세 번째 어 금 니를 추출, 신속 하 게 PBS와 린스, 매체와는 15ml 테스트 튜브에 넣고 2 시간 미만에 실험실으로 전송.
- 생물 학적 후드 코로나 가공 패스 병렬 및 펄프 챔버의 지붕을 통해 접선 하 여 치아 커터 엽니다.
- 부드럽게 작은 굴 삭 기와 펄프를 제거 하 고 테스트 튜브에.
- PBS로 3 회 세척 하 고 실시간에 10 분 동안 2500 x g 에서 원심
2. 치과 펄프의 줄기 세포 분리 처리
- 제거는 상쾌한, 행 크의 솔루션에는 펠 릿을 resuspend 및 페 트리 접시에. 5% CO2에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어.
-
4 콜라 솔루션 준비를 입력 합니다.
- DMEM L. 0.8 mL를 준비
- 유형 IV 콜라 DMEM과 몇 분 동안 소용돌이의 0.8 ml의 1 m g을 녹여.
- DMEM L 추가 최종 농도를 1 mL을 1 mg/mL.
- 0.22 μ M 필터 솔루션을 필터링 합니다.
- RT에서 10 분 동안 2500 x g 에서 원심 분리 하 여 행 크의 솔루션을 제거 하 고 일회용 메스와 각자 작은 조각 approximatively 1 m m으로 펄프를 분할.
- 펄프 조각을 페 트리 접시에 놓고 유형 IV 콜라 5% CO2에서 37 ° C에서 15 분의 1 mL와 함께 품 어.
-
중간 문화 준비 (500 mL)입니다.
- DMEM-L과 L-글루타민의 445 ml.
- 소 태아 혈 청 (FBS) (10%)의 50 mL를 추가 합니다.
- 페니실린/스 (1%)의 5 mL를 추가 합니다.
- RT에서 10 분 동안 2500 x g 에서 샘플 원심, 제거는 상쾌한, 5% CO2에서 37 ° C에서 줄기 세포에 대 한 특정 T25 플라스 크에 문화와 매체 (2.5 단계)에서 펠 릿 resuspend.
3. 줄기 세포 배양 및 전파
- 매일 매일 문화를 확인 하 고, 3 일 후의 성장, 플라스 크 내의 부착 세포의 다른 클론을 관찰.
- 3 일 마다 문화 매체를 변경합니다.
- 7 ~ 12 일, 부착 셀 범위 합류, 일단 분리 그들 트립 신-EDTA 37 ° C에서 3 분의 1 mL로 세포 치료 또는 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 부드럽게 합니다.
- 트립 신 작업 중지 문화 매체 (2.5 단계)의 4 ml (비율 1:5)를 추가 합니다.
- 259 x g6 분에 대 한 세포 현 탁 액을 원심, 제거는 상쾌한 고 전파 T25 플라스 크에 세포를 배치.
참고: 3 일 마다 셀 합류에 도달합니다. - 비-줄기 세포 문화에와 같은 존재를 피하기 위해 21 ~ 28 일 (약 6-8 구절)까지 셀을 전파 합니다.
- 트립 신-EDTA 부드럽게 된다고 37 ° C에서 3 분의 1 mL로 세포를 분리 합니다. 셀 서 스 펜 션 259 x g6 분에 대 한 원심
- 제거는 상쾌한 고 cytofluorimetric 분석 (6 단계)에 대 한 셀을 테스트 합니다.
4. 과도 PrPC Silencing siRNA에 의해
- 24 시간 배양 (2.5 단계)의 2 개 mL와 hDPSCsin 6 잘 플레이트 (2 x 105 셀/mL) 문화.
-
다음날, siRNA PrP 매체 (400 µ L)를 준비 합니다.
- 멸 균 시험관에 추가 384 µ L DMEM L.
- DMEM-l 5의 최종 농도를 1 µ L siRNA PrP의 각 유형에 대 한 추가 nM (4 siRNA PrP 사용 하 고 최저 효율 ≥70 %를 보장 하는 공급자에 의해 확인 되었다).
- DMEM L. transfectionreagent의 12 µ L 추가
- 소용돌이 혼합물과 transfection 단지의 형성 수 있도록 RT에서 10 분 동안 품 어.
- 각 샘플에 siRNA PrP 매체의 400 μ를 추가 하 고 37 ° c.에 6 h에 대 한 품 어
- SiRNA PrP 매체를 폐기 하지 않고 문화 매체 (2.5 단계)의 1.6 mL (1 ~ 5의 비율)을 추가 합니다.
- 37 ° c.에서 72 h에 대 한 셀을 두고
- 상쾌한을 제거 하 고 3 번 실시간에 PBS의 2 mL로 씻어
- 7 / 14 일 (단계 5.1)에 대 한 신경 문화 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 3 일 마다 신경 문화 매체를 변경 합니다.
참고: SiRNA PrP 솔루션 각 시간 바꾸기 신경 문화 매체를 교체 합니다. - 시간의 끝에, RT에서 PBS의 2 mL로 3 번 세척 하 고 서쪽 오 점 분석에 의해 신경 표면 항 원에 대 한 테스트.
5. 신경 유도 과정 hDPSCs
-
신경 문화 매체 준비 (500 mL)입니다.
- 신경 세포에 공식화 하는 기저 미디어의 444.7 mL를 준비 합니다.
- 매체에 배아와 성인 신경 줄기 세포 (10%)의 장기 생존 능력을 지 원하는 데 사용 되는 혈 청 무료 보충의 50 mL를 추가 합니다.
- 매체 (최종 농도 20 ng/mL)를 200 µ L의 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) (최종 농도가 40 ng/mL) 및 100 µ L 표 피 성장 인자 (EGF)를 추가 합니다.
- 페니실린/스 (1%)의 5 mL을 추가 하는 매체.
- 6 잘 플레이트 (2 x 105 셀/mL)에 문화 hDPSCs 펄프 분리에서 28 일까지 고 신경 문화 매체의 2 mL와 함께 그들을 자극 하는 것.
- 3 일 마다 삭제는 상쾌한, RT에서 PBS의 2 mL로 3 번 세척 하 고 신경 문화 매체의 2 개 mL를 대체.
- 7 / 14 일 후, 트립 신-EDTA 37 ° C에서 3 분의 1 mL 또는 부드럽게를 스 크레이 퍼 셀을 분리 합니다.
- 문화 매체 (2.5 단계) trypsin 작업 중지의 4 mL (비율 1:5)를 추가 합니다.
- 교류 cytometry 분석에 의해 프리온 단백질 표정 (7 단계) 나 신경 표면 항 원 (6 단계)의 존재에 대 한 테스트.
6입니다. hDPSCs Flow Cytometry로의 특성
- 선택 mesenchymal stromal (MSC)-특정 또는 신경 표면 항 원.
- 문화 문화 매체 (2.5 단계)의 2 개 mL와 6 잘 플레이트 (2 x 105 셀/mL)에서 hDPSCs.
- 28 일 치과 펄프 분리 또는 37 ° C 또는 부드럽게 스 크레이 퍼에 3 분에 대 한 트립 신-EDTA의 1 mL와 신경 문화 매체 (단계 5.1)의 14 일 후에 hDPSCs를 분리 합니다.
- 트립 신 행동을 막으려고 문화 매체 (2.5 단계)의 4 ml (비율 1:5)을 추가 하 고 259 x에서 centrifugate g 실시간에서 6 분에 대 한 다른 2 mL의 PBS로 2 회에 세척 실시간
- 4 ° c.에서 10 분에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 치료 또는 치료 hDPSCs를 수정
- 0.1% (v/v) 비 이온 계면 활성 제 PBS에서 실시간에 추가 10 분으로 hDPSCS를 permeabilize
- 실시간에서 1 시간에 대 한 PBS의 1 mL에 5% 탈지 말린 우유와 함께 차단 수행
- 1 mL의 PBS로 3 회 세척 하 고 안티 CD105 셀을 품 어 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-CD44 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-CD90 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-CD73 (1: 100 / 5 x 105 셀), β3-Tubulin 안티 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-NFH (1: 100 / 5 x 105 셀)와 안티-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 셀) 실시간에서 1 h mAb
- 셀 1 mL의 PBS로 3 회 세척 하 고 반대로 마우스 PE (1시 50분/5 105 셀 x) 또는 반대로 토끼 CY5 품 어 (1시 50분/105 셀 x 5) mAb 실시간에 추가 1 시간에 대 한
- 게이팅 (반대로 마우스 PE 또는 반대로 토끼 CY5 mAb) immunopositive 세포에 대 한 2 차 항 체를 사용 하 여 교류 cytometer와 모든 샘플을 분석 하 고 적어도 20000 이벤트를 취득.
7. hDPSCs Flow Cytometry 분석에 PrPC 식의 평가
- 문화 문화 매체 (2.5 단계)의 2 mL와 함께 hDPSCsin 6 잘 플레이트 (2 x 105 셀/mL).
- 21, 28 일 치과 펄프 분리에서 트립 신-EDTA의 1 mL와 신경 문화 매체 (5.1 단계)와 7 / 14 일 후에 hDPSCs를 분리 하 고 단계 6.4에에서 설명 된 대로 trypsin 작업 중지. 표본 4% paraformaldehyde PBS에 4 ° c.에서 10 분으로 수정
- 0.1% (v/v) 비 이온 surfactantin PBS 10 분에 대 한 실시간 제거에서와 상쾌한 permeabilize 고 얼룩 토끼 안티-PrP mAb EP1802Y (1시 50분/105 셀 x 5) 셀 mAb 실시간 품 방지 토끼 CY5 (1시 50분/105 셀 x 5)에서 1 시간에 대 한 대 한 mAb 실시간에 추가 1 시간
- 교류 cytometer와 모든 샘플을 분석 하 고 적어도 20000 이벤트를 확보.
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Representative Results
세 번째 모 랄에서 얻은 치과 펄프에서 hDPSCs의 격리 및 분리 절차는 작은 변화 파괴적인 결과 발생할 수 있는 복잡 한 프로세스. 이 문서에서 사용 하는 프로토콜의 아서 외. 12 여러 가지 개선입니다. 절차의 대표적인 구조는 그림 1에 표시 됩니다.
hDPSCs 셀 별개 복제와 증식 및 차별화 용량7,8차이의 이종 인구를 나타냅니다. 펄프 분리 및 펄프의 작은 파편의 시드, 후 주변에 확장 하는 셀의 클러스터 관찰 합니다. 그림 2 는 4 일 (중앙 패널)과 7 일 (오른쪽 패널) 치과 펄프 분리에서 1 일 (왼쪽된 패널)에 셀의 작은 클러스터를 보여준다. 일반적으로, 셀의 이러한 클러스터 7 ~ 12 일 사이 약 합류에 도달 성장.
이러한 셀 EGF/bFGF에 의해 유도 된 신경 감 별 법 후에 있는 그들의 성장을 줄일 수 하 고, 2 주 후 셀 형태학 및 neurites 파생물 (그림 3)에 상당한 변화를 관찰 하는 것이 가능 했다.
그림 4, 우리는 치료 hDPSCs multipotent mesenchymal stromal 특정 표면 항 원 CD44, CD90, CD105, CD73, 및 STRO-15,9등 익스프레스 표시 됩니다. 그렇지 않으면, 적절 한 신경 유도 자극 후 hDPSCs β3-Tubulin, NFH, 및 GAP43 같은 특정 신경 마커를 표현 한다. hDPSCs, 치료 또는 치료로 신경 유도 자극 CD14 CD19 등 조 혈 마커를 표현 하지 않습니다.
그림 5, 우리는 hDPSCs 익스프레스 조 PrPC (21, 28 일) 및 추가 7 ~ 14 일에 대 한 EGF/bFGF에 의해 유도 된 신경 감 별 법 과정 후 PrPC 콘텐츠 증가그림 5(A) 표시 됩니다. 이후 여러 저자 PrPC 신경 세포 분화에 관여는 보고, 우리 생 PrPC 이 과정에서의 역할을 평가. 따라서, 작은 간섭 RNA (siRNA PrP) ablate PrPC 와 그것의 기능에 적용 되었습니다. 14 일 동안 EGF/bFGF 자극 하기 전에 72 h에 대 한 siRNA와 전처리 신경 마커 b 3-tubulin 및 NHF (그림 5B)의 표현을 방지합니다. 데이터는 siRNA로 PrPC 의 입을 hDPSCs, 2 주 후 EGF/bFGF에 의해 유도 된 신경 분화 과정에 영향을 보여줍니다.
그림 1 : 세 번째 어 금 니에서 치과 펄프 분리의 계획. 치아는 코로나 가공 패스 병렬 및 펄프 챔버의 지붕을 통해 탄젠트에 의해 커터 개설 되었습니다 고 펄프 부드럽게 작은 굴 삭 기와 무 균 조건 하에서 제거 되 고 테스트 튜브에 배치. 행 크의 솔루션 치료 후, 펄프, 조각으로 잘라와 콜라 4 15 분 치료 되었고 T25 플라스 크에 전파. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 단계 대조 현미경에 의해 치과 펄프 분리에서 다른 일에 hDPSCs 형태학. 다른 일 (1, 4, 7) 치과 펄프 분리에서 치과 펄프에서 hDPSCs의의 형태로 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 단계 대조 현미경에 의해 hDPSCs의 Neurite 결과. 치과에서 hDPSCs의 형태는 14 일에 대 한 치료 또는 치료와 EGF/bFGF 펄프. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : hDPSCs 특성. CD44, CD90, CD105, CD73, STRO-1, CD14, CD19, β3-Tubulin, NFH 및 GAP43 hDPSCs 치료 또는 EGF/bFGF 14 일에 대 한 치료 식의 흐름 cytometry 분석. 히스토그램을 나타내는 로그 형광 vs 셀 번호, 문이 측면 분산형/앞으로 분산형의 세포 인구에 (SS/FS) 히스토그램. 각 패널은 부정적인 컨트롤로 해당 보조 항 체와 비교 되었다. 3 중 대표적인 실험 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : HDSPCs의 신경 분화 중 PrPC 의 역할. (A) PrPC 식의 Cytofluorimetric 분석 치료 (치과 펄프 분리에서 21, 28 일) 및 신경 유도 미디어 EGF/bFGF와 추가 7 및 14 일 후. 각 패널은 해당 IgG 부정적인 isotype 제어와 비교 되었다. 3 중 대표적인 실험 표시 됩니다. (B) 신경 마커 β3-Tubulin NFH 식 (28 일 치과 펄프 분리에서) 서쪽 오 점 분석 및 신경 유도 미디어 EGF/bFGF siRNA PrP의 유무에서 추가 14 일 후. 이 그림 5 (A, B) "프리온 단백질-EGFR multimolecular 복잡 한 인간의 치과 펄프 파생 된 줄기 세포의 신경 분화 중의 역할" 23. 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 작품에서는, 우리가 격리와 hDPSCs;의 신경 분화에 대 한 방법론에 초점을 맞춘 또한, 우리는이 과정에서 PrPC 의 역할 평가. 분리 과정에서 신경 세포와 같은 세포에 중요 한 단계는 hDPSCs를 차별화 하는 여러 방법이 있다. hDPSCs는 chondroblasts, adipocytes, osteoblasts, 신경 등 여러 계보에서 차별화 수 있습니다. 우리 신문, 우리 신경 감 별 법의 메커니즘 및 PrPC의 존재를 조사. 위에서 설명 했 듯이, 이러한 세포 STRO 1 CD44, CD90, CD105, CD73, 및10,,2526같은 전형적인 엽 stromal 특정 표면 항을 표현 한다.
프로토콜, 몇 가지 중요 한 단계는 분리 절차의 실패를 일으킬 수 있습니다. 첫 번째 중요 한 단계는 환자27의 선택에 의해 표시 됩니다. 우리의 경험에서 우리는 기증자의 그 증가 나이 발견 (> 20) 점차적으로 확산의 능력 및 줄기 세포의 분화를 감소 시킨다. 우리의 실험에서 우리는 세 번째 어 금 니 세 13-19 세의 환자에서 약물 또는 알코올 소비의 이전 역사 없이, 모든 비 흡연와 적절 한 구강 위생 excised 사용.
두 번째 중요 한 단계는 줄기 세포 분리 절차의 주요 핫 단계를 나타내는 수 펄프 조직에서 세포를 분리 하는 효소의 선택에 의해 표시 됩니다. 사실, 우리는 깨달았다 I 및 II, 너무 공격적 수 있는 효소는 콜라의 사용 분리 과정에서 펄프 조직에 세포 손상 될 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 콜라 콜라 보다 낮은 tryptic 활동의이 종류 타입 I과 II 때문에 콜라 IV를 사용 하기로 결정 했다. 절차에 따라 정확 하 게는, 줄기 세포 치료 치아의 90%에서를 얻을 수 있다.
분리, 후 hDPSCs를 포함 하는 솔루션을 피하기 위해 존재의 비-줄기 세포 문화에 6 ° 통로 (approximatively 21-28 일)까지 적절 한 플라스 크에 교양 이다. 28 일, 그들은 (위 참조)으로 전형적인 엽 항 원의 존재에 대 한 테스트 되었고 그들은 긍정 했다 경우에 실험을 위해 사용. 실제로, hDPSCs에 수 년에 걸쳐 만든 진전에도 불구 하 고 있다 아직도 중요 한 제한 인구의 극단적인이 성분으로 표현.
와 같이 여러 작가 의해, 다른 인구 종류 치과 펄프에 있으며, 현재까지, 그것은 알 수 없는 각 엽 계보 (chondroblasts, adipoblasts, osteoblasts 또는 신경 세포)로 분화 할 수 가장 좋은 고기는 무엇입니까. 우리와 다른 프로시저의 현재 한계를 피하기 위해, 다음 단계는 특정 고기를 사용 하 여 특정 단일 클론 항 체와 세포 인구를 선택 될 것입니다.
이전 작품에서는, 우리는 PrPC hDPSCs에서 표현 된다 다는 것을 보였다. 사실, 21 일 및 28 일에서 PrPC 콘텐츠의 증가에 약한 양성을 관찰 가능 하다. 또한, 우리는 신경 유도 EGF/bFGF 중재 동안 PrPC 콘텐츠 더욱 증가 했다 관찰 했다. 또한, 우리는 신경 유도 과정의 hDPSCs에 생 PrPC 의 역할을 조사. PrPC 의 과도 입을 EGF/bFGF23에 의해 유도 된 hDPSCs의 분화 과정을 방지.
우리는 미세 조정 하 고 격리, 분리와 간단 하 고 다재 다능 한 절차와 hDPSCs의 생체 외에서 재배 방법을 개선. 이러한 혁신 보다 효율적인 세포 클론 및 중간 엽 줄기 세포의 대규모 확장을 허용 합니다. 또한, 우리는 hDPSCs는 우수한 실험 모델 MSCs 신경 분화 과정의 세포 및 분자 메커니즘을 연구 하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 "피코 Varrone" 및 티 대학 허브 "사비 나 Universitas" 빈첸초 Mattei에 의해 지원 되었다.
그림 5 (A, B) 테일러 & 프랜시스 회사에서 게시자의 허가 reprinted: 역할의 프리온 단백질-EGFR multimolecular 복잡 한 인간의 치과 펄프 파생 된 줄기 세포의 신경 분화 하는 동안. Martellucci, S., Manganelli V. Santacroce C., Santilli F., 자녀 가족 L., Sorice M., Mattei V. 프리온. 3 월 4 2018입니다. 테일러 & 프랜시스
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
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