用心脏灌注和二固定仪对脑和垂体血管进行标记
Summary
本文介绍了一种快速的协议, 通过心脏灌注的心脏灌注的 DiI 稀释在固定, 使用 medaka (Oryzias latipes) 作为模型, 并侧重于大脑和垂体组织的远端鱼的血管标记。
Abstract
血管刺激脊椎动物的所有组织, 通过提供必要的营养、氧气和激素信号来维持它们的生存。它是最早在发展过程中开始运作的机构之一。血管形成机制已成为具有高度科学和临床意义的课题。然而, 在成人中, 由于大多数活体动物在其他组织深处的定位, 很难想象它们的血管结构。然而, 血管可视化仍然是重要的几个研究, 如内分泌和神经生物学。虽然斑马鱼已经开发出了一些转基因系, 血管通过荧光蛋白的表达直接可视化, 但其他远程物种没有这样的工具。利用 medaka (Oryzias latipes) 作为模型, 目前的协议提出了一种快速和直接的技术, 通过灌注通过心脏与含有 dii 的固定剂, 大脑和垂体的血管标签。该协议可以提高我们对大脑和垂体细胞如何在整个组织或厚组织切片中与血管相互作用的理解。
Introduction
血管是脊椎动物身体的重要组成部分, 因为它们为所有器官提供必要的营养、氧气和激素信号。另外, 自从发现他们参与癌症发展1以来, 他们在临床研究中受到了很大的关注。尽管一些出版物研究了允许血管生长和形态发生的机制, 并确定了大量对其形成很重要的基因, 但关于相互作用, 还有很多需要了解的地方细胞或组织与循环血液之间。
在大脑和垂体中的血液血管的可视化是重要的。大脑中的神经元需要大量的氧气和葡萄糖,脑垂体中含有多达八种重要的产生激素的细胞, 这些细胞使用血液流动接收来自大脑的信号, 并将各自的激素传递给不同的细胞外周器官4,5。而在哺乳动物中, 下丘脑底部的门户系统命名为中位隆起, 连接大脑和垂体 6, 这样一个清晰的血桥还没有在远程鱼中描述过。事实上, 在远程测试中, 垂体前神经元直接将轴突投射到垂体7的神经部分, 主要直接支配不同的内分泌细胞类型 8,9.然而, 这些神经元中的一些神经元的神经末梢位于血管外空间, 靠近血毛细血管10。因此, 远端鱼和哺乳动物之间的区别并不那么明显, 血液血管与大脑和脑垂体细胞之间的关系需要对远端鱼进行更深入的研究。
斑马鱼在许多方面都有一个解剖和功能上可比于其他脊椎动物物种的血管系统11。它已成为心血管研究的强大脊椎动物模型, 主要是由于几个转基因线的发展, 其中血管系统的组成部分被标记为荧光记者蛋白 12。然而, 确切的循环系统解剖可能因物种而异, 甚至在属于同一物种的两个个体之间也会有所不同。因此, 血管的可视化可能也是高度感兴趣的其他远程物种, 其中不存在转基因工具。
在哺乳动物和心灵中, 有几种技术可以给血管贴上标签。其中包括血管特异性基因的原位杂交、碱性磷酸酶染色、微血管造影和染料注射 (评论见13)。荧光亲脂性阳离子阳离子 (dii) 首次用于研究膜脂质侧向迁移, 因为它保留在脂质双层中, 并可通过它迁移14,15,16。事实上, DiI 的一个分子是由两个碳链和色谱联。当碳氢化合物链整合在与之接触的细胞的脂质双层细胞膜中时, 染色体仍保留在其表面17。一旦进入膜, DiI 分子在脂质双层内横向扩散, 这有助于染色不直接与 DiI 溶液接触的膜结构。因此, 通过心脏灌注注射 DiI 溶液, 会给所有与该化合物接触的内皮细胞贴上标签, 允许直接给血管贴标签。今天的 DiI 也被用于其他染色目的, 如单分子成像, 命运映射, 和神经元追踪。有趣的是, 存在几种荧光 (具有不同波长的发射), 允许与其他荧光标签的组合, DiI 的结合以及横向扩散可以发生在活组织和固定组织18,19岁
1893年由百丁氏发现的甲醛, 至今已被广泛用作组织固定的首选化学物质20,21。它显示了广泛的特异性为大多数细胞目标并且保留了细胞结构22,23。它还保留了大多数荧光的荧光特性, 因此可用于固定目标细胞表达荧光报告蛋白的转基因动物。
在这份手稿中, 以前的一个协议开发的血管标签的小实验哺乳动物模型 24 已适应在鱼类中的使用。整个过程只需几个小时就可以完成。它展示了如何在鱼的心脏中灌注含有 DiI 的甲醛固定溶液, 以便直接标记大脑中的所有血管和垂体模型的鱼美达卡。Medaka 是一种原产于亚洲的小型淡水鱼, 主要分布在日本。它是一个研究模型生物与一套分子和遗传工具可用25。因此, 在这个物种以及其他物种的血管的识别将允许提高我们对大脑和垂体细胞如何在整个组织或厚组织切片中与血液血管相互作用的理解。
Protocol
Representative Results
Discussion
心脏灌注与 DiI 以前已被用来标记血管在几个模型种类24, 包括远程鱼13.
由于 DiI 是通过血管内的灌注直接传递到内皮细胞膜, 因此可以通过增加固定溶液中的 DiI 浓度来提高信噪比。此外, 荧光体在激发时提供强烈的染色, 以最小的漂白方式允许相对持久的排放18,30。此外, 标记可以保留几?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Kanda 真司博士在 medaka 演示心脏灌注固定溶液, 卢尔德家乐福 g Tan 女士在医疗管理方面提供帮助, 并感谢 Anthony Peltier 先生的插图。这项工作由 NMBU 和挪威研究理事会资助, 赠款号码为 248828 (挪威数字生活方案)。
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
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