Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI
Summary
El artículo describe un protocolo rápido para etiquetar los vasos sanguíneos en un pez teleósteo por perfusión cardíaca de DII diluido en fijador, usando medaka (Oryzias latipes) como modelo y centrándose en el cerebro y el tejido pituitario.
Abstract
Los vasos sanguíneos inervan todos los tejidos en los vertebrados, lo que permite su supervivencia proporcionando los nutrientes necesarios, oxígeno, y las señales hormonales. Es uno de los primeros órganos que empiezan a funcionar durante el desarrollo. Los mecanismos de formación de los vasos sanguíneos se han convertido en un tema de alto interés científico y clínico. En los adultos sin embargo, es difícil visualizar la vasculatura en la mayoría de los animales vivos debido a su localización profunda dentro de otros tejidos. Sin embargo, la visualización de los vasos sanguíneos sigue siendo importante para varios estudios como Endocrinología y Neurobiología. Mientras que varias líneas transgénicas se han desarrollado en el pez cebra, con los vasos sanguíneos directamente visualizados a través de la expresión de proteínas fluorescentes, no existen tales herramientas para otras especies teleósteo. Usando medaka (Oryzias latipes) como modelo, el protocolo actual presenta una técnica rápida y directa para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis mediante el perfundiendo a través del corazón con fijador que contiene DII. Este protocolo permite mejorar nuestro entendimiento sobre cómo las células cerebrales y pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejidos enteros o rebanadas gruesas de tejido.
Introduction
Los vasos sanguíneos desempeñan una parte esencial del cuerpo vertebrado, ya que proporcionan los nutrientes necesarios, el oxígeno y las señales hormonales a todos los órganos. También, desde el descubrimiento de su participación en el desarrollo del cáncer1, han recibido mucha atención en la investigación clínica. Aunque una serie de publicaciones han investigado los mecanismos que permiten el crecimiento de los vasos sanguíneos y la morfogénesis, y un gran número de genes importantes para su formación se han identificado2, queda mucho por entender en cuanto a la interacción entre las células o los tejidos y la sangre circulante.
La visualización de la vasculatura sanguínea en el cerebro y la hipófisis es importante. Las neuronas en el cerebro requieren un alto suministro de oxígeno y glucosa3, y la hipófisis contiene hasta ocho importantes tipos de células productoras de hormonas que utilizan el flujo sanguíneo para recibir la señal del cerebro y enviar sus respectivas hormonales a diferentes órganos periféricos4,5. Mientras que en los mamíferos, el sistema del portal en la base del hipotálamo llamado la eminencia mediana, une el cerebro y la hipófisis6, tal un puente sanguíneo claro no se ha descrito en el pez teleósteo. De hecho, en teleosts, neuronas preoptico-hipotalámica proyectar directamente sus axones en el pars nerviosa de la hipófisis7 y en su mayoría inervate los diferentes tipos de células endocrinas directamente8,9. Sin embargo, algunas de estas neuronas tienen sus terminaciones nerviosas ubicadas en el espacio extravascular, cerca de los capilares sanguíneos10. Por lo tanto, la diferencia entre el pez teleósteo y los mamíferos no es tan clara, y la relación entre la vasculatura sanguínea y el cerebro y las células pituitarias requiere una mayor investigación en los peces teleósteo.
El pez cebra tiene, en muchos aspectos, un sistema vascular anatómico y funcionalmente comparable a otras especies de vertebrados11. Se ha convertido en un poderoso modelo de vertebrados para la investigación cardiovascular principalmente gracias al desarrollo de varias líneas transgénicas donde los componentes del sistema vascular están etiquetados con proteínas reporteras fluorescentes12. Sin embargo, la anatomía exacta del sistema circulatorio puede variar entre especies, o incluso entre dos individuos pertenecientes a la misma especie. Por lo tanto, la visualización de los vasos sanguíneos puede ser de gran interés también en otras especies teleósteo para las cuales no existen herramientas de transgénesis.
Se han descrito varias técnicas para etiquetar los vasos sanguíneos tanto en mamíferos como en teleostos. Estos incluyen la hibridación in situ para genes específicos de la vasculatura, la tinción de fosfatasas alcalinas, la microangiografía y las inyecciones de tinte (para una revisión ver13). Colorante indocarbocianine catiónico fluorescente lipofílico (DII) primero se utilizó para estudiar la movilidad lateral de lípidos de membrana, ya que se retiene en las bicapas de lípidos y puede migrar a través de él14,15,16. De hecho, una molécula de DiI se compone de dos cadenas de hidrocarburos y cromos. Mientras que las cadenas de hidrocarburos se integran en la membrana de la célula bicapa lipídica de las células en contacto con ella, los cromos permanecen en su superficie17. Una vez en la membrana, las moléculas DiI se difunden lateralmente dentro de la bicapa lipídica que ayuda a manchar las estructuras de la membrana que no están en contacto directo con la solución DiI. Inyectar una solución DiI a través de la perfusión cardíaca, por lo tanto etiquetará todas las células endoteliales en contacto con el compuesto permitiendo el etiquetado directo de los vasos sanguíneos. Hoy DiI también se utiliza para otros fines de tinción, como la imagen de una sola molécula, mapeo del destino, y rastreo neuronal. Curiosamente, existen varios fluoróforos (con diferentes longitudes de onda de emisión) permitiendo la combinación con otras etiquetas fluorescentes, y la incorporación, así como la difusión lateral de DiI puede ocurrir en los tejidos vivos y fijos18, 19.
El formaldehído, descubierto por Ferdinand Blum en 1893, se ha utilizado ampliamente hasta el día de hoy como el producto químico preferido para la fijación del tejido20,21. Muestra una amplia especificidad para la mayoría de los objetivos celulares y preserva la estructura celular22,23. También preserva las propiedades fluorescentes de la mayoría de los fluoróforos, y por lo tanto se puede utilizar para fijar animales transgénicos para los cuales las células dirigidas expresan proteínas reporteras fluorescentes.
En este manuscrito, un protocolo anterior desarrollado para etiquetar los vasos sanguíneos en pequeños modelos experimentales de mamíferos24 se ha adaptado al uso en peces. Todo el procedimiento tarda solo un par de horas en realizarse. Se demuestra cómo perfumar una solución fijadora de formaldehído que contiene DiI en el corazón de pescado con el fin de etiquetar directamente todos los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis de la medaka modelo de pescado. Medaka es un pequeño pez de agua dulce originario de Asia, que se encuentra principalmente en Japón. Es un organismo modelo de investigación con un conjunto de herramientas moleculares y genéticas disponibles25. Por lo tanto, la identificación de los vasos sanguíneos en esta especie, así como en otros permitirá mejorar nuestra comprensión sobre cómo el cerebro y las células pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejido entero o rebanadas de tejido grueso.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perfusión cardíaca con DII previamente se ha utilizado para etiquetar los vasos sanguíneos en varias especies modelo24, incluyendo el pez teleósteo13.
Como DiI es entregado directamente a la membrana de la célula endotelial por perfusión en la vasculatura, es posible aumentar la relación señal-ruido mediante el aumento de la concentración de DiI en la solución fijadora. Además, el fluoróforo proporciona una coloración i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Shinji Kanda la demostración de perfusión cardiaca con solución fijadora en medaka, la Sra. Lourdes Carreon G tan para obtener ayuda con la cría de medaka y el Sr. Anthony Peltier para las ilustraciones. Este trabajo fue financiado por la NMBU y por el Consejo de investigación de Noruega, concesión número 248828 (programa de vida de Noruega digital).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
Riferimenti
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