DiI による心灌流を用いた Teleost 脳および下垂体の血管の標識
Summary
本稿は、DiI の心臓灌流を固定で希釈し、メダカ (Oryzias latipes) をモデルとして使用し、脳と下垂体組織に焦点を当てて、teleost 魚の血管を標識するための迅速なプロトコールについて説明する。
Abstract
血管は、脊椎動物のすべての組織を innervate し、必要な栄養素、酸素、ホルモンシグナルを提供することによって生存を可能にします。それは開発の間に機能し始める最初の器官の1つである。血管形成のメカニズムは、高い科学的、臨床的関心の対象となっています。.しかし、成人では、他の組織の深部への局在のために、ほとんどの生物動物の血管系を可視化することは困難である。それにもかかわらず、内分泌学や神経生物などのいくつかの研究において、血管の可視化は依然として重要である。ゼブラフィッシュにはいくつかの遺伝子導入ラインが開発されていますが、蛍光タンパク質の発現によって血管が直接視覚化されるため、他の teleost 種にはそのようなツールは存在しません。モデルとしてメダカ (Oryzias latipes) を使用して、現在のプロトコルは、DiI を含む固定液と心臓を介して等量によって脳と下垂体の血管を標識するための迅速かつ直接的な技術を提示します。このプロトコルは、脳と下垂体細胞が全体の組織または厚い組織スライスにおける血液脈管系と相互作用する方法についての我々の理解を改善することができます.
Introduction
血管は、すべての臓器に必要な栄養素、酸素、ホルモンシグナルを提供するため、脊椎動物の身体に不可欠な役割を果たします。また、がん開発に関与していることが発見されて以来、臨床研究において注目を集めています。多くの刊行物が血管の成長と形態形成を可能にするメカニズムを調査しており、その形成に重要な多数の遺伝子が同定されているが、その相互作用に関しては多くの理解が残っている細胞または組織と循環血液との間。
脳と下垂体の血液血管系の可視化が重要です。.脳内のニューロンは、酸素とグルコース3の高い供給を必要とし、下垂体は、脳からの信号を受信し、異なるにそれぞれのホルモンを送信する血流を使用して8つの重要なホルモン産生細胞の種類が含まれています末梢器官4,5.哺乳動物において、その中央値と称される視床下部の基部にある門脈システムは、脳と下垂体6とを結んでおり、このような明確な血中ブリッジは teleost 魚には記載されていない。実際には、魚類では、preoptico 視床下部ニューロンは直接下垂体7のパルスに軸索を投影し、主に異なる内分泌細胞の種類を直接8、9に innervate。しかし、これらのニューロンのいくつかは、血管外空間に位置する神経終末を有し、毛細血管10に近接している。したがって、teleost の魚と哺乳類の違いはそれほど明確ではなく、血液の脈管構造と脳と下垂体細胞との間の関係は teleost 魚においてより大きな調査を必要とする。
ゼブラフィッシュは、多くの局面において、他の脊椎動物種11に対して解剖学的および機能的に匹敵する血管系を有する。これは、血管系の成分が蛍光レポータータンパク質12で標識されているいくつかのトランスジェニック線の開発のおかげで主に心血管研究のための強力な脊椎動物モデルとなっている。しかし、正確な循環系の解剖学的構造は、種によって、あるいは同じ種に属する2人の個体間でも変化し得る。したがって、血管の可視化は、今後ツールが存在しない他の teleost 種においても高い関心を持つ可能性がある。
哺乳動物および魚類の両方で血管を標識するいくつかの技術が記載されている。これらには、脈管系特異的遺伝子の in situ ハイブリダイゼーション、アルカリホスファターゼ染色、microangiography、および色素注射が含まれる (レビューについては13を参照)。蛍光性の脂溶性カチオン indocarbocyanine 色素 (DiI) は、脂質りん中に保持されている膜脂質横移動を研究するために最初に使用され、そしてそれを介して移行することができる14,15,16.実際、DiI の分子は、2つの炭化水素鎖と発色団で構成されている。炭化水素鎖はそれに接触している細胞の脂質二重層細胞膜に統合されるが、発色団はその表面17上に残る。一度膜に、DiI 分子は、DiI 溶液と直接接触していない膜構造を染色するのに役立つ脂質二重層内に横方向に拡散します。心臓灌流によって DiI 溶液を注入すると、化合物と接触しているすべての内皮細胞に標識し、血管の直接標識を可能にする。今日 DiI は、単一分子イメージング、運命のマッピング、ニューロンのトレースなどの他の染色の目的にも使用されます。興味深いことに、いくつかの蛍光色素が存在し (異なる波長の発光)、他の蛍光標識との組み合わせを可能にし、DiI の横方向の拡散とともに、ライブおよび固定組織18の両方で発生する可能性があります。19.
ホルムアルデヒドは、1893年にフェルディナンド・ブルームによって発見され、組織固定20,21のための好ましい化学物質として現在の日に広く使用されるようになった。それはほとんどの細胞のターゲットのための広い特異性を示し、細胞構造22,23を維持する。また、ほとんどの蛍光色素の蛍光特性を保持しているため、標的細胞が蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニック動物の固定に使用することができます。
この原稿においては、小実験哺乳動物モデル24における血管を標識するために開発された以前のプロトコルは、魚類における使用に適合している。手順全体を実行するには数時間しかかかりません。これは、直接脳内のすべての血管とモデル魚のメダカの下垂体にラベルを付けるために魚の心臓に DiI を含むホルムアルデヒドの定着性溶液を perfuse する方法を示しています。メダカはアジア原産の小さな淡水魚で、主に日本で見られます。これは、利用可能な分子および遺伝学的ツールのスイートと研究モデルの生物であります25.したがって、この種だけでなく、他の人における血管の同定は、脳と下垂体細胞が全体の組織または厚い組織スライス中の血液脈管系と相互作用する方法についての我々の理解を改善することを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
DiI を用いた心臓灌流は、以前は、teleost 魚13を含むいくつかのモデル種24において血管を標識するために使用されてきた。
DiI が脈管系において灌流によって内皮細胞膜に直接送達されるように、固定液中の DiI 濃度を増加させることによってシグナル対雑音比を増加させることができる。さらに、蛍光色素分子は、最小限の漂?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、メダカの定着性溶液による心灌流の実演をして神田先生に感謝し、メダカ・・キャリオンの助けをしてくれるように、ルルドの G タンと、イラストのためにアンソニー・ペルチェ氏を。この作品は、NMBU とノルウェーの研究評議会によって資金を供給されました, グラント番号 248828 (デジタルライフノルウェープログラム).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
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