Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative
Summary
O artigo descreve um protocolo rápido para a rotulagem de vasos sanguíneos em um peixe teleósteo por perfusão cardíaca de DII diluído em fixador, usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo e focando no cérebro e tecido hipofisário.
Abstract
Os vasos sanguíneos inervam todos os tecidos em vertebrados, permitindo a sua sobrevivência, proporcionando os nutrientes necessários, oxigênio, e sinais hormonais. É um dos primeiros órgãos a começar a funcionar durante o desenvolvimento. Mecanismos de formação de vasos sanguíneos tornaram-se um assunto de alto interesse científico e clínico. Em adultos no entanto, é difícil visualizar a vasculatura na maioria dos animais vivos devido à sua localização profunda dentro de outros tecidos. No entanto, a visualização dos vasos sanguíneos permanece importante para vários estudos, como Endocrinologia e neurobiologia. Enquanto várias linhas transgênicas foram desenvolvidas em zebrafish, com vasos sanguíneos visualizados diretamente através da expressão de proteínas fluorescentes, não existem tais ferramentas para outras espécies teleósteo. Usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo, o protocolo atual apresenta uma técnica rápida e direta para rotular vasos sanguíneos no cérebro e hipófise por perfusing através do coração com fixador contendo DII. Este protocolo permite a melhoria de nossa compreensão em como o cérebro e as pilhas pituitárias interagem com o vasculatura do sangue no tecido inteiro ou em fatias grossas do tecido.
Introduction
Os vasos sanguíneos desempenham uma parte essencial do corpo vertebrado como eles fornecem os nutrientes necessários, oxigênio e sinais hormonais para todos os órgãos. Além disso, desde a descoberta de seu envolvimento no desenvolvimento do câncer1, eles receberam muita atenção na pesquisa clínica. Embora um número de publicações investigaram os mecanismos permitindo o crescimento e a morfogênese do vaso sanguíneo, e um grande número genes importantes para sua formação foram identificados2, muito remanesce ser compreendido a respeito da interação entre células ou tecidos e o sangue circulante.
A visualização da vasculatura sanguínea no cérebro e na hipófise é importante. Os neurônios no cérebro exigem uma alta oferta de oxigênio e glicose3, e a hipófise contém até oito tipos importantes de células produtoras de hormônio que usam o fluxo sanguíneo para receber sinal do cérebro e enviar seus respectivos hormônios para diferentes órgãos periféricos4,5. Enquanto em mamíferos, o sistema portal na base do hipotálamo nomeou a Eminência mediana, liga o cérebro e a hipófise6, tal uma ponte de sangue clara não foi descrita em peixes teleósteo. Na verdade, nos teleosts, os neurônios preoptico-hipotálamo projetam diretamente seus axônios na pars nervosa da hipófise7 e inervam principalmente os diferentes tipos de células endócrinas diretamente8,9. No entanto, alguns desses neurônios têm suas terminações nervosas localizadas no espaço extravascular, em estreita proximidade com capilares sanguíneos10. Portanto, a diferença entre peixes e mamíferos teleósteo não é tão clara, e a relação entre a vasculatura sanguínea e o cérebro e as células Hipofisárias requer maior investigação em peixes teleósteo.
O zebrafish tem, em muitos aspectos, um sistema vascular anatomicamente e funcionalmente comparável a outras espécies de vertebrados11. Transformou-se um modelo poderoso do vertebrados para a pesquisa cardiovascular na maior parte agradecimentos ao desenvolvimento de diversas linhas transgênicas onde os componentes do sistema vascular são etiquetados com as proteínas fluorescentes do repórter12. No entanto, a anatomia do sistema circulatório exato pode variar entre as espécies, ou mesmo entre dois indivíduos pertencentes à mesma espécie. Portanto, a visualização dos vasos sanguíneos pode ser de grande interesse também em outras espécies teleósteo para as quais as ferramentas de transgénese não existem.
Várias técnicas foram descritas para rotular vasos sanguíneos em mamíferos e teleosts. Estes incluem a hibridação in situ para genes vasculature-específicos, a mancha alcalina da fosfatase, a microangiografia, e as injeções da tintura (para uma revisão vêem13). A tintura catiônica lipofílica fluorescente do indocarbocyanine (DII) foi usada primeiramente para estudar a mobilidade lateral dos lipídios da membrana porque é mantida nos bicamadas do lipido e pode migrar com ele14,15,16. De fato, uma molécula de DiI é composta por duas cadeias de hidrocarbonetos e cromophores. Quando as correntes do hidrocarboneto se integrarem na membrana de pilha do BICAMADA do lipido das pilhas no contato com ela, os cromóforos permanecem em sua superfície17. Uma vez na membrana, as moléculas DiI se difusas lateralmente dentro da bicamada lipídica que ajuda a manchar estruturas de membrana que não estão em contato direto com a solução DiI. Injetando uma solução DiI através de perfusão cardíaca, portanto, rotular todas as células endoteliais em contato com o composto permitindo a rotulagem direta dos vasos sanguíneos. Hoje DiI também é usado para outros fins de coloração, tais como a imagem única molécula, mapeamento de destino, e Rastreamento neuronal. Curiosamente, existem vários fluoróforos (com diferentes comprimentos de onda de emissão) permitindo a combinação com outros rótulos fluorescentes, e a incorporação, bem como a difusão lateral de DiI pode ocorrer em ambos os tecidos vivos e fixos18, a 19.
O formaldeído, descoberto por Ferdinand Blum em 1893, tem sido amplamente utilizado nos dias atuais como o produto químico preferencial para fixação tecidual20,21. Mostra ampla especificidade para a maioria dos alvos celulares e preserva a estrutura celular22,23. Igualmente preserva as propriedades fluorescentes da maioria de Fluorophores, e assim pode ser usado para fixar os animais transgênicas para que as pilhas alvejadas expressam proteínas fluorescentes do repórter.
Neste manuscrito, um protocolo prévio desenvolvido para rotular vasos sanguíneos em pequenos modelos experimentais de mamíferos24 foi adaptado ao uso em peixes. O procedimento inteiro leva apenas um par de horas para executar. Ele demonstra como perfuse uma solução fixativa de formaldeído contendo DiI no coração de peixe, a fim de etiquetar diretamente todos os vasos sanguíneos no cérebro e da hipófise do modelo de peixe Medaka. Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrado principalmente no Japão. É um organismo modelo de pesquisa com um conjunto de ferramentas moleculares e genéticas disponíveis25. Portanto, a identificação dos vasos sanguíneos nesta espécie, bem como em outros permitirá melhorar a nossa compreensão sobre como o cérebro e as células Hipofisárias interagem com a vasculatura sanguínea em tecido inteiro ou fatias de tecido espesso.
Protocol
Representative Results
Discussion
A perfusão cardíaca com DII anteriormente tem sido usada para rotular vasos sanguíneos em várias espécies-modelo24, incluindo peixes teleósteo13.
Como DiI é diretamente entregue à membrana celular endotelial por perfusão na vasculatura, é possível aumentar a relação sinal-ruído, aumentando a concentração de DiI na solução fixativa. Além, o fluoróforo fornece a mancha intensa quando excitado com o clareamento mínimo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Shinji Kanda pela demonstração de perfusão cardíaca com solução fixativa em Medaka, Sra. Lourdes Carreon G Tan, para obter ajuda com a criação de Medaka, e o Sr. Anthony Peltier para ilustrações. Este trabalho foi financiado pela NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concedem o número 248828 (programa de vida digital da Noruega).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
Riferimenti
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. . Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Biologia dello sviluppo. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochimica. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
