Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative
Summary
Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll für die Beschriftung von Blutgefäßen in einem teleost Fisch durch Herzvermischung von DiI verdünnt in Fixierung, mit medaka(Oryziaslatipes) als Modell und die Konzentration auf Gehirn und Hypophyse Gewebe.
Abstract
Blutgefäße innervate alle Gewebe in Wirbeltieren, so dass ihr Überleben durch die Bereitstellung der notwendigen Nährstoffe, Sauerstoff und hormonellen Signale. Es ist eines der ersten Organe, das während der Entwicklung zu funktionieren beginnt. Mechanismen der Blutgefäßbildung sind zu einem Gegenstand von hohem wissenschaftlichem und klinischem Interesse geworden. Bei Erwachsenen ist es jedoch schwierig, die Vaskulatur bei den meisten lebenden Tieren zu visualisieren, da sie tief in anderen Geweben lokalisiert sind. Dennoch bleibt die Visualisierung von Blutgefäßen für mehrere Studien wie Endokrinologie und Neurobiologie wichtig. Während mehrere transgene Linien in Zebrafischen entwickelt wurden, wobei Blutgefäße direkt durch die Expression fluoreszierender Proteine visualisiert wurden, gibt es für andere Teleost-Arten keine solchen Werkzeuge. Mit medaka (Oryziaslatipes) als Modell präsentiert das aktuelle Protokoll eine schnelle und direkte Technik, um Blutgefäße im Gehirn und Hypophyse zu kennzeichnen, indem es durch das Herz mit Fixativ-haltigen DiI pariert. Dieses Protokoll ermöglicht eine Verbesserung unseres Verständnisses darüber, wie Gehirn-und Hypophysenzellen mit der Blutvaskulatur in ganzerem Gewebe oder dicken Gewebescheiben interagieren.
Introduction
Blutgefäße spielen einen wesentlichen Teil des Wirbelkörpers, da sie allen Organen die notwendigen Nährstoffe, Sauerstoff und Hormonsignale liefern. Seit der Entdeckung ihrer Beteiligung an der Krebsentwicklung1 habensie auch in der klinischen Forschung viel Aufmerksamkeit erhalten. Obwohl eine Reihe von Publikationen die Mechanismen untersucht haben, die das Wachstum von Blutgefäßen und die Morphogenese ermöglichen, und eine große Anzahl von Genen identifiziert wurden, die für ihre Entstehung wichtig sind, bleibt eine Menge hinsichtlich der Interaktion zu verstehen. Zwischen Zellen oder Gewebe und dem zirkulierenden Blut.
Die Visualisierung der Blutvaskulatur im Gehirn und der Hypophyse ist wichtig. Neuronen im Gehirn benötigen eine hohe Versorgung mit Sauerstoff und Glukose 3, und die Hypophyseenthältbis zu acht wichtige hormonproduzierende Zelltypen, die den Blutfluss nutzen, um Signal aus dem Gehirn zu empfangen und ihre jeweiligen Hormone an verschiedene Peripheriegorgeln4,5. Während bei Säugetieren das Portalsystem an der Basis des Hypothalamus, der Median eminence genannt wird, das Gehirn mit der Hypophyse6verbindet, ist eine so klare Blutbrücke bei Teletischen Fischen nicht beschrieben worden. In der Tat projizieren präoptiko-hypothalamische Neuronen in Teleoern ihre Axone direkt in die Pars nervosa der Hypophyse 7 und innervate die verschiedenen endokrinen Zelltypen direkt8,9. Einige dieser Neuronen haben jedoch ihre Nervenenden im extravaskulärenRaum, in unmittelbarer Nähe zu Blutkapillaren 10. Daher ist der Unterschied zwischen Teleostfischen und Säugetieren nicht so klar, und die Beziehung zwischen der Blutvaskulatur und dem Gehirn und Hypophysen erfordert eine stärkere Untersuchung bei Teleost-Fischen.
Zebrafische haben in vielerlei Hinsicht ein anatomisch und funktionell vergleichbares Gefäßsystem mit anderen Wirbeltierarten 11. Es ist ein leistungsfähiges Wirbelsäulenmodell für die kardiovaskuläre Forschung geworden, vor allem dank der Entwicklung mehrerer transgener Linien, bei denen Komponenten des Gefäßsystems mit fluoreszierenden Reporterproteinen 12 gekennzeichnet sind. Die genaue Anatomie des Kreislaufsystems kann jedoch zwischen den Arten oder sogar zwischen zwei Individuen der gleichen Art variieren. Daher kann die Visualisierung von Blutgefäßen auch bei anderen Teleost-Arten von großem Interesse sein, für die es keine Transgenese-Werkzeuge gibt.
Es wurden verschiedene Techniken beschrieben, um Blutgefäße sowohl bei Säugetieren als auch bei Teleosten zu kennzeichnen. Dazu gehören die In-situ-Hybridisierung für vaskulurspezifische Gene, die alkalische Phosphatase-Färbung, die Mikroangiographie und die Farbstoffinjektionen(für eine Rezension siehe 13). Fluoreszierender lipophiler kationischer Indocarbocyanin-Farbstoff (DiI)wurde zum ersten Mal verwendet, um Membran-Lipide seitliche Beweglichkeit zu untersuchen, da es in den Lipidbilayern gespeichert wird und durch sie 14,15,16wandernkann. Tatsächlich besteht ein Molekül von DiI aus zwei Kohlenwasserstoffketten und Chromophoren. Während sich die Kohlenwasserstoffketten in die Lipidbilayer-Zellmembran der Zellen integrieren, die mit ihr in Kontakt stehen, bleiben die Chromophores auf ihrer Oberfläche17. Einmal in der Membran, diffundieren DiI-Moleküle seitlich innerhalb des Lipidbilayers, was hilft, Membranstrukturen zu verfärben, die nicht in direktem Kontakt mit der DiI-Lösung stehen. Die Injektion einer DiI-Lösung durch Herzdurchblutung wird daher alle Endothelzellen in Kontakt mit der Verbindung kennzeichnen, die eine direkte Kennzeichnung der Blutgefäße ermöglicht. Heute wird DiI auch für andere Färbezwecke verwendet, wie zum Beispiel die Bildgebung von Einzelmolekülen, die Schicksalskartierung und die neuronale Verfolgung. Interessanterweise gibt es mehrere Fluorophores (mit unterschiedlichen Wellenlängen der Emission), die die Kombination mit anderen Fluoreszenzetiketten ermöglichen, und die Einverleibung sowie die seitliche Diffusion von DiI kann sowohl in lebendenals auch festen Geweben 18auftreten, 19. November
Formaldehyd,dasFerdinand Blum 1893 entdeckte, wird bis heute als bevorzugte Chemikalie für die Gewebefixierung20,21weitverbreitet. Es zeigt eine breite Spezifität für die meisten zellulären Zieleundbewahrt die Zellstruktur 22,23. Es bewahrt auch die fluoreszierenden Eigenschaften der meisten Fluorophoren und kann so zur Fixierung transgener Tiere verwendet werden, für die gezielte Zellen fluoreszierende Reporterproteine ausdrücken.
In diesem Manuskript wurde ein früheres Protokoll entwickelt, um Blutgefäße in kleinen experimentellen Säugetiermodellen24 zu kennzeichnen, um die Verwendung in Fischen zu verwenden. Die gesamte Prozedur dauert nur ein paar Stunden. Es zeigt, wie man eine fixierte Lösung von Formaldehyd, das DiI im Fischherz enthält, perfektioniert, um alle Blutgefäße im Gehirn und die Hypophyse des Modells Fisch medaka direkt zu kennzeichnen. Medaka ist ein kleiner Süßwasserfisch, der in Asien beheimatet ist, vor allem in Japan. Es handelt sich um einen Forschungsmodellorganismus mit einer Reihe von molekularen und genetischen Werkzeugen, diezurVerfügung stehen 25. Daher wird die Identifizierung von Blutgefäßen in dieser Art und in anderen ermöglichen, unser Verständnis darüber zu verbessern, wie das Gehirn und Hypophysen mit Blutvaskulatur in ganzen Gewebe oder dicken Gewebeseischen interagieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Herzvermischung mit DiI wurde zuvor zur Kennzeichnung von Blutgefäßen in mehreren Modellarten24verwendet, darunter auch Teleost-Fische 13.
Da DiI durch Perfusion in der Vaskulatur direkt in die Endothelzellmembran geliefert wird, ist es möglich, das Signal-Rauschen-Verhältnis zu erhöhen, indem die DiI-Konzentration in der Fixlösung erhöht wird. Darüber hinaus sorgt das Fluorophor für eine intensive Färbung, wenn es mit mi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Shinji Kanda für die Demonstration der Herzversionen mit fixierender Lösung in Medaka, Frau Lourdes Carreon G Tan für die Hilfe bei der Medaka-Haltung und Herrn Anthony Peltier für Illustrationen. Diese Arbeit wurde von der NMBU und vom Forschungsrat Norwegens, Grant Nummer 248828 (Digital Life Norway Programm), finanziert.
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
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