Summary
Aquí se presenta un protocolo optimizado para aislar, cultivar, transfectar y diferenciar a los monocitos primarios humanos de individuos infectados por el VIH y controles saludables.
Abstract
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sigue siendo un importante problema de salud a pesar de la introducción de la terapia antirretroviral combinada (CART) a mediados de la década de 1990. Si bien la terapia antirretroviral reduce eficientemente la carga viral sistémica y restaura el recuento normal de células CD4+ T, no reconstituye un sistema inmunitario completamente funcional. Un sistema inmunitario disfuncional en individuos infectados por el VIH sometidos a cART puede caracterizarse por activación inmune, envejecimiento temprano de las células inmunitarias o inflamación persistente. Estas condiciones, junto con factores comorbilidadasociadoes con la infección por vih, añaden complejidad a la enfermedad, que no se puede reproducir fácilmente en modelos celulares y animales. Para investigar los eventos moleculares subyacentes a la disfunción inmune en estos pacientes, aquí se presenta un sistema para cultivar y manipular monocitos primarios humanos in vitro. Específicamente, el protocolo permite el cultivo y la transfección de CD14primarios + monocitos obtenidos de individuos infectados por el VIH sometidos a cART, así como de controles VIH-negativos. El método implica aislamiento, cultivo y transfección de monocitos y macrófagos derivados de monocitos. Mientras que se emplean kits y reactivos disponibles en el término comercial, el protocolo proporciona consejos importantes y condiciones optimizadas para la adherencia exitosa y la transfección de monocitos con imitaciones e inhibidores de miRNA, así como con siRNAs.
Introduction
La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) causa disfunción inmune grave, que puede conducir a infecciones oportunistas y síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Aunque los pacientes infectados por el VIH sometidos a cART se caracterizan por bajas cargas virales y recuentos normales de células CD4+ T, el funcionamiento del sistema inmunitario puede verse comprometido en estos individuos, lo que conduce a una respuesta inmune disfuncional que se ha relacionado con un mayor riesgo de desarrollar cáncer1. Los mecanismos de disfunción inmunitaria en pacientes con VIH en el cART siguen siendo en gran medida desconocidos. Por lo tanto, caracterizar las células inmunitarias derivadas del paciente e investigar su biología y función es un componente crítico de la investigación actual sobre el VIH.
Los monocitos y macrófagos son reguladores clave de las respuestas inmunitarias y desempeñan un papel fundamental en la infección por VIH2,3,4,5. De naturaleza heterogénea y plástica, los macrófagos pueden clasificarse ampliamente en activados clásicamente (M1) o activados alternativamente (M2). Si bien esta clasificación general es necesaria al establecer condiciones experimentales, el estado de polarización de los macrófagos puede ser invertido por una variedad de citoquinas6,7,8,9. Aunque varios estudios han investigado los efectos de la infección por VIH en monocitos y células dendríticas, los detalles moleculares de las respuestas mediadas por monocitos son en gran medida desconocidos6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Entre los factores involucrados en la regulación y función de las células inmunitarias, se ha demostrado que los microARN (miRNAs), los ARN cortos no codificantes que regulan la expresión génica posttranscripción, desempeñan un papel importante en el contexto de las principales vías celulares (es decir, crecimiento, diferenciación, desarrollo y apoptosis)20. Estas moléculas han sido descritas como reguladores importantes de los factores de transcripción esenciales para dictar la polarización funcional de los macrófagos21. Se ha investigado el papel potencial de los miRNAs en los monocitos de personas infectadas por el VIH que se someten a cART, pero el progreso en el campo requiere mucho más trabajo22,23,24,25,26. Este artículo analiza un método optimizado para transfectar miRNAs y siRNAs en monocitos humanos primarios de pacientes y controles infectados por el VIH.
Este protocolo se basa en reactivos y kits disponibles comercialmente, ya que la continuidad en el procedimiento técnico ayuda a eliminar variables experimentales innecesarias cuando se trabaja con muestras clínicas. Sin embargo, el método proporciona consejos importantes (es decir, el número de células chapadas o una incubación breve con medios libres de suero para promover la adherencia de las células a la placa). Además, las condiciones de polarización utilizadas en este protocolo se derivan de la obra publicada27,28,29.
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Protocol
Todos los métodos descritos a continuación han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Louisiana State University En New Orleans. Toda la sangre fue recolectada después de obtener el consentimiento informado.
NOTA: Todo el procedimiento se realiza en condiciones estériles en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) para que se tenga precaución para manipular materiales biológicos. En particular, cada paso se realiza utilizando técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad. Después de cada paso que involucre sangre, hemicidas, células o pipeteo de productos celulares, es importante enjuagar todo el material plástico (es decir, pipetas serológicas, puntas de pipeta y tubos) con 10% de lejía de un contenedor de residuos dentro de la campana antes de la eliminación adecuada.
1. Aislamiento de monocitos humanos primarios por selección negativa inmunomagnética
- Recoger 40 ml de sangre entera humana fresca (ya sea de un VIH+ paciente o un control saludable) en cuatro tubos de vacío de ácido etilendiaminetetraacético de 10 ml (EDTA) (10 ml de sangre por tubo). Utilizando técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad, transfiera los 40 ml de sangre a un tubo cónico de propileno de 50 ml.
- Siguiendo el protocolo del fabricante para el kit de aislamiento de monocitos humanos seleccionado(Tabla de Materiales),añadir 2 ml de cóctel de aislamiento de monocitos, proporcionado en el kit, al tubo de sangre. Cuentas magnéticas vórtice, también proporcionadas en el kit, para 30 s, y añadir 2 ml al tubo de sangre.
- Si hay menos de 40 ml de sangre disponible, reduzca la escala de los reactivos añadidos. Para mezclar la solución, pipetee hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de plástico de 25 ml e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Separe la mezcla de sangre por igual en cuatro tubos de 50 ml y agregue 30 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) que contenga 1 mM de EDTA a cada tubo. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de plástico de 25 ml.
- Coloque los tubos en soportes de imanes durante 10 minutos para eliminar las perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos. Utilice cuatro soportes de imán simultáneamente, uno para cada tubo, para permitir tiempos de incubación y aislamiento constantes para cada muestra de sangre.
- Dibuje el contenido desde el centro de cada tubo, utilizando una pipeta, mientras todavía están en los soportes del imán. Tenga cuidado de no extraer glóbulos rojos (no más del 10% del volumen inicial de 10 ml) y coloque el contenido en uno de los cuatro nuevos tubos de 50 ml.
- Añadir 500 l de perlas magnéticas vórtices a cada tubo de 50 ml. Pipetear arriba y abajo con una pipeta de 25 ml e incubar a RT durante 5 min. A continuación, coloque los tubos en soportes de imanes durante 5 minutos.
- Transfiera cuidadosamente el contenido desde el centro de cada tubo mientras todavía está en soportes de imanes en uno de los cuatro nuevos tubos de 50 ml. Coloque directamente cada tubo nuevo de 50 ml en los soportes del imán durante 5 minutos.
- Transfiera cuidadosamente el contenido desde el centro de cada tubo a uno de los cuatro nuevos tubos de 50 ml. Gire los nuevos tubos de 50 ml a 300 x g durante 5 min. Apiratee el sobrenadante y resuspenda los cuatro pellets celulares en un total de 10 ml de PBS estéril.
- Cuente las células mediante la exclusión azul de trypan usando un hemocitómetro.
NOTA: 8-20 x 106 células se obtienen generalmente a partir de 40 ml de sangre entera.
2. Cultivo de monocitos humanos primarios
- Utilizando un baño de agua de 37 oC, los medios cálidos DE RPMI 1640 sin suero suplementados con 1% de penicilina-estreptomicina (lápiz/estreptococo) y (mientras continúan utilizando técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad) resuspenden los monocitos aislados en este medio a una concentración de 1 x 106 células/ml.
- Añadir 1 ml de células resuspendidas a cada pozo de una placa de 6 pocillos o a un plato de 35 mm (el número final de células debe ser 1 x 106 células/placa), y colocar en una incubadora de 37 oC con 5% de CO2. Espere 0.5-1.0 h para que las células se adhieran.
- Usando un baño de agua de 37 oC, suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor caliente (HI). Añadir 100 l (10% de concentración final) de FBS a cada placa. Añadir factores de crecimiento a las células para promover la diferenciación de macrófagos.
- Macrófagos de primera calidad para un fenotipo similar al M1 añadiendo 25 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) a los medios. Macrófagos primos para un fenotipo similar a M2 añadiendo 50 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) a los medios28.
NOTA: Tanto GM-CSF como M-CSF permiten la diferenciación de monocitos a un fenotipo de macrófago general (M0) mientras ceba las células para M1 o M2, respectivamente7,28,30.
- Macrófagos de primera calidad para un fenotipo similar al M1 añadiendo 25 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) a los medios. Macrófagos primos para un fenotipo similar a M2 añadiendo 50 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) a los medios28.
3. Transfectar monocitos humanos primarios en cultivo
- Monocitos transfectos con miRNA imita o inhibitorios o siRNA utilizando un kit que contiene un reactivo de transfección a base de polímeros (Tabla de materiales).
- Siguiendo el protocolo del fabricante para el kit de transfección (y continuando el uso de técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad), primero diluir los miRNA seleccionados imita/inhibidores o siRNAs en el tampón a una concentración final de 1,83 m. Preparar 10 ml de imitación/inhibidor diluido por transfección de 1 x 106 células.
- Preparar el reactivo de transfección añadiendo 1 l del polímero suministrado a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml, seguido inmediatamente añadiendo 90 ml de tampón proporcionado (para un total de 91 ml de reactivo por transfección). Vórtice para 3-5 s.
- Pipetear 90 l de solución de transfección en el tubo que contiene 10 ml de miRNA diluido imitando/inhibidor o siRNA. Mezclar con pipeteo suave e incubar durante 15 min a RT.
- Añadir 100 l de complejo de transfección a un pozo (o plato) de 1 x 106 monocitos chapados. Incubar células durante 4 h a 37 oC, luego reemplazar el medio con 3 ml de medios completos (RPMI 1640 complementado con 1% de penicilina-estreptomicina y 10% FBS inactivado por calor) que contiene GM-CSF o M-CSF.
4. Diferenciación y activación M1/M2
- Los monocitos comienzan inmediatamente a diferenciarse a los amplios macrófagos M0 al enchapar en cultivo. En el tercer día después del chapado, continúe utilizando técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad y reemplace los medios por 3 ml de medios rmpi 1640 frescos (complementados con 1% de penicilina-estreptomicina, 10% FBS inactivado por calor y 25 ng/ml GM-CSF para promover la polarización similar a M1 o 50 ng/ml M-CSF para promover la polarización M2-like). Cultivo de las células en estas condiciones durante un total de 6 días desde el chapado inicial en una incubadora a 37oC, 5% CO2.
- Para avanzar en la polarización de las células cebadas al fenotipo M1-macrophage, active las células en el día 6 de la incubación reemplazando los medios celulares por nuevos medios que contengan un 5% de FBS inactivado por calor, un 1% de pluma/estreptococo, 100 ng/mL E. coli-lipopolisacárido derivado (LPS) y 20 ng/ml de interferón (IFN).
- Para avanzar en la polarización de las células cebadas al fenotipo M2-macrophage, active las células en el día 6 de la incubación reemplazando los medios celulares por nuevos medios que contengan un 5% de FBS inactivado por calor, un 1% de pluma/estreptococo, 10 ng/ml de M-CSF y una interleucina de 20 ng/ml 4 (IL-4).
- Después de 24 h, cosechar las células para análisis de ARN, proteína o citometría de flujo.
- Cuando las células estén listas para la recolección, lave las células en el plato 2x con PBS (en RT para la extracción de ARN o enfriada en hielo para la extracción de proteínas). Debido a que los macrófagos diferenciados ahora están firmemente unidos a las placas, atrevar las células en las placas directamente para obtener material para análisis de ARN y proteínas.
- Para la recolección de material para la citometría de flujo, añadir PBS que contenga 2 mM EDTA al plato, incubar las células durante 10 min a 37 oC, raspar suavemente las células del plato y recoger el contenido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml antes de proceder con los protocolos estándar.
5. Citometría de flujo
- Enjuague las células en PBS para eliminar el medio de cultivo. Esgire 100.000 células (por cada condición de citometría de flujo) y resuspenda el pellet en 100 ml de PBS que contenga 2 ml de inhibidor de unión HuFcR. Incubar a RT durante 15 min.
- Añadir 50 l de tampón de tinción y los anticuerpos deseados (aquí, CD80, CD83, CD163 y CD209 se utilizaron en las cantidades recomendadas.
- Mezclar suavemente e incubar a 4 oC en la oscuridad durante 30 min.
- Lavar 2 veces con PBS y resuspender las células manchadas en 150 oL de PBS antes de ejecutar la muestra en un citofluorímetro.
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Representative Results
Mediante el procedimiento descrito, se aislaron los monocitos humanos primarios de individuos infectados por el VIH y donantes sanos. Todos los datos presentados aquí se obtuvieron de VIH+ sujetos sometidos a cART con cargas virales bajas (<20 copias/ml) o indetectables y recuentonormal de células CD4+ T. Inmediatamente después del aislamiento, las células se teñían y se realizaba citometría de flujo para confirmar la pureza de las poblaciones celulares. Los resultados mostraron que >97% de las células manchadas positivas para CD14 (datos no mostrados). Para la polarización de macrófagos, se utilizó un protocolo publicado28. Los monocitos humanos primarios se cultivaron en presencia de GM-CSF o M-CSF durante 6 días. En el sexto día, las células se activaron hacia los macrófagos M1 o M2. Veinticuatro horas después de la activación, las células fueron cosechadas y teñidas para el análisis de citometría de flujo de marcadores celulares de macrófagos.
La Figura 1 muestra histogramas representativos de células de control activado Por M1(Figura 1A) y derivadas del paciente(Figura 1B)con niveles aumentados de CD80 y CD83 y disminución de los niveles de CD163 en comparación con las células T0 no activadas, así como las células activadas por M2 con niveles aumentados de CD163 y CD209. El panel C en muestra la expresión de CD80, CD83, CD163, y CD209 en las células polarizadas M1 y M2. El gráfico representa los datos medios obtenidos de tres conjuntos de células derivadas del VIH y de tres grupos de control. Como era de esperar, los niveles de expresión de CD80 y CD83 aumentaron en M1 en comparación con las células polarizadas M2, mientras que CD209 y CD163 se expresaron más en M2 en comparación con las células polarizadas M1. Curiosamente, CD80 y CD83 parecían estar más expresados en células derivadas del control en comparación con las células derivadas del VIH. Sin embargo, las posibles diferencias en la capacidad de polarizar y/o expresionar los niveles de marcadores de polarización en células derivadas del VIH en comparación con los controles requiere una investigación adicional. Aunque se eligieron GM-CSF, M-CSF, LPS e IFN-o como tratamientos, otras combinaciones de factores de crecimiento, citoquinas o estimuladores pueden utilizarse con este protocolo28.
Después de que los experimentos preliminares mostraron que el procedimiento de aislamiento fue exitoso, los monocitos recién recolectados fueron chapados en 6 placas de pozos y transpirados con un miRNA revuelto, con la etiqueta casi infrarroja, para determinar la eficiencia de la transfección. Las células fueron imágenes 24 h después de la transfección por microscopía fluorescente confocal. Con este método, se logró una eficiencia de transfección del >90%, determinada por la citometría de flujo(Figura 2A)y la microscopía confocal(Figura 2B).
A continuación, se determinó la viabilidad de las células después de la transfección. La Figura 3 muestra la viabilidad de las células, determinada según un ensayo colorimétrico como promedio de células derivadas de dos pacientes(Figura 3A)y dos controles(Figura 3B)transfectó en el día 1(Figura 3A)o en el día 4(Figura 3B)y cosechado en el día 7. Para este experimento, 50.000 células fueron chapadas en una placa de 96 pocillos múltiples y transfectó siguiendo el protocolo. En general, la transfección no redujo significativamente la viabilidad de las células, independientemente de la etapa de maduración de las células y de las condiciones de transfección (es decir, fiverona, siRNA/miRNA revuelto o siRNA/miRNA). Cabe señalar que la Figura 3 representa los datos obtenidos de células derivadas del paciente (panel A) y células derivadas del control (panel B). Esto era necesario, ya que no se pudieron obtener suficientes células para realizar el experimento completo (tanto la viabilidad como la mancha occidental para las transfecciones del día 1 y del día 4, en seis condiciones diferentes por transfección) con una sola muestra. Sin embargo, la figura proporciona resultados representativos que se pueden obtener con células derivadas del control o del paciente.
Luego, la eficacia de la transfección de siRNA en el ARNm objetivo se evaluó mediante la evaluación de la expresión proteica. Los resultados de la Figura 4 muestran una regulación efectiva de EIF4EBP1, un regulador traslacional muy abundante en estas células, tras la transfección con un siRNA específico tanto en el día 1(Figura 4A)como en el día 4(Figura 4C). El mismo regulador también mantuvo la expresión bajo las diversas condiciones de control (es decir, siRNA no transinfectado, simulado, revuelto y siRNA EIF4EBP1 sin reactivo de transfección: siR*). La cuantificación de los experimentos de la mancha occidental para la transfección del día 1 y del día 4 se muestra en la Figura 4B y la Figura 4D, respectivamente. Además, se determinaron los niveles de expresión de miR-146a-5p después de la transfección en el día 1 o el día 4 por RT-qPCR de células derivadas del VIH(Figura 4E). Las células transcloscadas con miRNA imitación mostraron un aumento de 48 a 72 veces en la expresión de miRNA sobre las células no transtróstrales, mientras que todos los controles de transfección no muestran cambios apreciables.
Figura 1: Los macrófagos derivados de monocitos se polarizan y activan con éxito hacia fenotipos de macrófagos M1 o M2. Los resultados del análisis de citometría de flujo de células derivadas de un control saludable (A) y una muestra de células derivadas del VIH (B) muestran niveles de CD80, CD83, CD163 y CD209. El experimento se repitió con dos controles adicionales y dos muestras vih-positivas adicionales con resultados similares. La población celular de interés estaba cerrada sobre la base de los parámetros de dispersión hacia adelante y del lado, seguido de la discriminación de doblete. (C) Gráfico de barras que muestra CD80, CD83, CD163 y CD209 en celdas polarizadas M1 y M2. El gráfico representa los datos promedio y las desviaciones estándar obtenidas de tres conjuntos de células derivadas del control (Ctrl) y tres derivadas del VIH (Pts). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las células humanas primarias CD14+ se transinfectan eficientemente con miRNAs. (A) Análisis de citometría de flujo de monocitos primarios derivados de controles saludables, 24 h después de la transfección, mostrando >90% de eficiencia de transfección. (B) La imagen confocal representativa tomada 24 h después de la transfección muestra que todas las células en el campo expresan el miRNA conjugado con un tinte infrarrojo cercano (en blanco). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Viabilidad de las células transinfectadas. Las barras gráficas representan la viabilidad celular promedio de dos pacientes VIH+ (A) y dos controles saludables (B) determinados mediante un ensayo colorimétrico, después de la transfección con miR-146a-5p o siRNA a EIF4EBP1 (siRNA) y los controles apropiados en el día 1 (A) o el día 4 (B), todos probados en el día 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Regulación eficiente de los niveles de proteínas tras la transfección de siRNA/miRNA después del aislamiento de CD14+ monocitos. Los monocitos derivados del VIH (1 x 106 células) se transtornaron en el día 1 (A) o en el día 4 (C) después del aislamiento utilizando siRNA contra el ARNm EIF4EBP1. Los paneles (B) y (D) representan la cuantificación de la expresión EIF4EBP1 en comparación con el GAPDH y se expresa como el porcentaje sobre el simulacro para el paciente (Pt) o el control (Ctrl) (A) o no transinfectado para el paciente o el control (B). (E) Gráfico representativo de barras de dos experimentos que muestran la expresión miR-146a-5p en células derivadas del VIH transferidas en el día 4 (barras 1-4) o el día 1 (barra derecha) y cosechados en el día 7. El cambio de pliegue se calcula sobre la muestra no transinfectada (siR - siRNA). siR* o miR-145a-5p* indican la incubación de las células con siRNA o miR-146a-5p sin el reactivo de transfección. El experimento se repitió 2 veces con células derivadas de control y produjo esencialmente los mismos resultados (datos no mostrados). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado demuestra el uso de células primarias de sujetos infectados por el VIH como modelo para estudiar monocitos y macrófagos. VIH+ pacientes sometidos a cART viven con infección durante varios años y también pueden tener otras coinfecciones relacionadas con un sistema inmunitario comprometido. Para estudiar la inmunomodulación en presencia de infección crónica por VIH, las células se extraían directamente de los pacientes. Como se ha demostrado que los miRNAs desempeñan un papel importante en el desarrollo y la diferenciación celular, el protocolo se centra en la capacidad de manipular la expresión de miRNA en estas células primarias(Figura 2, Figura 3, Figura 4). Usando el mismo procedimiento, este protocolo también funciona muy bien para siRNAs(Figura 3, Figura 4). Debido a la actividad fagocítica potencial de los macrófagos maduros, además de los controles de siRNA simulado y revuelto, se utiliza un control (indicado como siR* o miR* en la Figura 3 y la Figura 4),en el que se omite el reactivo de transfección. Los datos confirman que el reactivo de transfección es necesario para la entrega adecuada de siRNA/miRNA en las células, ya que sin el reactivo, las células no toman espontáneamente el miRNA o el siRNA, incluso cuando ya están diferenciadas en macrófagos (día 4 después del chapado y la polarización, Figura 3 y Figura 4).
Si bien se utilizan kits disponibles comercialmente para el aislamiento y la transfección de CD14 primario seres humanos+ monocitos, hay pasos clave optimizados para que el procedimiento sea reproducible y exitoso. Específicamente, 1) el número de células chapadas es crítico para su supervivencia y diferenciación, y 1 x 106 células/ 35 mm plato se encontró que funciona mejor. 2) Las células CD14+ recién aisladas no se adhieren uniformemente a la placa de cultivo si se sembran en presencia de FBS. Como consecuencia, al reemplazar el medio 4 h después de la transfección, todas las celdas no conectadas se eliminarán, haciendo que las condiciones de placa a placa sean altamente variables. 3) Se encontró que la sustitución del medio 4 h después de la transfección, reduce la toxicidad debido a los reactivos de transfección sin afectar a la eficiencia de la transfección. 4) Las condiciones de transfección se optimizaron para requerir menos siRNA o miRNA (15 nM) que las concentraciones recomendadas por el fabricante (25 nM). 5) Debido a la naturaleza altamente adherente de las células, la adición de tampón de lisis directamente a la placa mejora en gran medida la concentración de proteínas o ARN cosechado. Sin embargo, si es necesario eliminar las células de la placa (es decir, para el análisis de citometría de flujo), es mejor utilizar PBS con EDTA y raspar suavemente las células. Este método reduce el número de celdas recopiladas en aproximadamente 20%-30%, por lo que es importante planificar los experimentos en consecuencia para obtener números de celda suficientes para su posterior análisis.
Cuando se sigue correctamente, este procedimiento demuestra la obtención de CD14 + altamente purosin monocitos, transfección de siRNAs y ARN pequeños como miRNAs, condiciones de cultivo, y diferenciación en macrófagos M1 o M2. Este método se puede aplicar para estudiar enfermedades o infecciones complejas distintas del VIH.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al núcleo de biorepositorio clínico/tumor de VIH por proporcionar muestras de pacientes y el núcleo de metabolismo de inmunología celular por proporcionar análisis de citometría de flujo. Este proyecto fue financiado por NIH P20GM121288 y P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
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