Summary
Hier presenteren we een mechanisch dissociatie protocol om macrofagen snel te isoleren van de dorsale wortel ganglion voor fenotypering en functionele analyse.
Abstract
Er zijn groeiende belangen om te bestuderen van de moleculaire en cellulaire interacties tussen immune cellen en sensorische neuronen in de rugwortel ganglia na perifere zenuw letsel. Perifere monocytische cellen, waaronder macrofagen, zijn bekend om te reageren op een weefsel letsel door middel van fagocytose, antigeen presentatie, en cytokine vrijlating. Opkomende bewijsmateriaal impliceerde de bijdrage van rugwortel ganglia macrofagen aan neuropathische pijn ontwikkeling en axonale reparatie in de context van zenuw letsel. Snel fenotypen (of "snelle isolatie van") de reactie van rugwortel ganglia macrofagen in de context van zenuw letsel is gewenst om de onbekende neuroimmuunfactoren te identificeren. Hier laten we zien hoe ons lab snel en effectief macrofagen isoleert van de dorsale wortel ganglia met behulp van een enzymvrij mechanisch dissociatie protocol. De monsters worden op het ijs gehouden om cellulaire stress te beperken. Dit protocol is veel minder tijdrovend in vergelijking met het standaard enzymatische protocol en is routinematig gebruikt voor onze fluorescentie-geactiveerde Celsorterings analyse.
Introduction
Er is nu aanzienlijk bewijs dat immuuncellen bijdragen aan de neuropathische pijn na beschadiging van de perifere zenuw1,2. Perifere monocytische cellen, waaronder volwassen macrofagen, zijn bekend om te reageren op weefsel letsel en systemische infectie door middel van fagocytose, antigeen presentatie, en cytokine vrijlating. Parallel aan de zenuw letsel-geïnduceerde Microglia activering in de ruggenmerg rughoorn, macrofagen in de dorsale wortel ganglia (DRG) ook uit te breiden aanzienlijk na zenuw letsel3,4. Met name, er zijn groeiende belangen om te bepalen als macrofagen bijdragen tot neuropathische pijn ontwikkeling na perifere zenuw letsel door interactie met sensorische neuronen in de DRG5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Bovendien betrekken recente studies ook de bijdrage van DRG-macrofagen in de axonale herstelling na zenuwbeschadiging12,13. Een andere studie suggereert verder dat macrofaag subpopulaties (d.w.z. CD11b+Ly6CHi en CD11b+Ly6Clage/- cellen) een andere rol kunnen spelen in de mechanische overgevoeligheid14. Daarom kan het snel fenotypen van de reactie van DRG-macrofagen in de context van zenuw letsel ons helpen neuroimmuunfactoren te identificeren die bijdragen aan neuropathische pijn.
Conventioneel, het protocol voor het isoleren van macrofagen in de DRG omvat meerdere stappen, met inbegrip van enzymatische spijsvertering15,16. De techniek is vaak tijdrovend en kan kostbaar zijn voor grootschalige experimenten. Hoewel milde spijsvertering met collagenase type II (4 mg/mL) en dispase type II (4,7 mg/mL) gedurende 20 minuten werd aanbevolen eerder15, is het denkbaar dat cellen na de blootstelling aan dit enzym gevoelig zijn voor celbeschadiging of celdood, wat kan leiden tot lage Opbrengst. Bovendien kan het verschil in de kwaliteit van enzymen van batch tot batch de efficiëntie van dit proces verder beïnvloeden. Belangrijker is dat macrofagen die worden blootgesteld aan de spijsvertering van het enzym ongewenst gestimuleerd worden en dus zeer verschillend kunnen zijn van de in vivo status. De veranderingen kunnen de uitkomst van de functionele studie compliceren.
Hier beschrijven we een enzymvrij protocol om DRG-macrofagen snel te isoleren bij 4 °C met behulp van mechanische dissociatie. De monsters worden op ijs gehouden om cellulaire stress te beperken. Als gevolg daarvan biedt onze aanpak een voordeel om de consistentie van de isolatie te behouden, en de geïsoleerde cellen zijn vermoedelijk gezonder en minder gestimuleerd. We presenteren verder het bewijsmateriaal om de kwaliteit van de geïsoleerde cellen te valideren met de analyse van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier experimenten werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Californië in San Francisco en werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Verzamel lumbale DRG van experimentele muizen
- Voordat u begint met het experiment, bereidt u de werkoplossing voor van het dichtheidsgradiënt medium (bijv. Percoll) door 9 volumes van het medium te mengen met 1 volume van CA+ +/mg+ +-vrije 10x HBSS. Houd het op ijs.
- Anesthetiseer de muis met 2,5% Avertin. Bevestig dat het dier volledig verdoofd door het gebrek aan reactie op de Hind paw pinch.
Opmerking: zowel mannelijke als vrouwelijke muizen in de leeftijd van 6-8 weken werden gebruikt. - Parfumeer de muis transcardially met 10 mL voorgekoelde 1x PBS.
- Plaats de muis in de liggende positie met vier poten vastgezet met de tape in een chemische rook afzuigkap. Til de huid onder de ribbenkast door de Tang en maak een kleine incisie met een chirurgische schaar om de lever en het diafragma bloot te leggen.
- Blijf de schaar gebruiken om het diafragma en de ribbenkast te knippen, open de pleuraholte om het kloppend hart bloot te leggen.
- Snijd snel de rechter atriale aanhangsel met Iris schaar. Zodra het bloeden is genoteerd, plaats een 30 G naald in het achterste uiteinde van de linker ventrikel, en Injecteer langzaam 10 mL voorgekoelde 1x PBS om het dier te parfumeriseren.
- Voer rugvin laminectomie15 op de muis geplaatst op de liggende positie.
Opmerking: als de celcultuur is gepland, spray dan de muis met 70% ethanol voor incisie en gebruik voorgesteriliseerde chirurgische instrumenten voor dissectie.- Gebruik een maat 11 scalpel om een longitudinale laterale diepe incisies te maken vanaf het thoracale gebied tot aan het sacrale gebied. Verwijder de huid door de schaar om de rugspier laag bloot te leggen.
- Gebruik Friedman-Pearson Rongeur om de bindweefsels en spieren af te pellen totdat de lumbosacrale-wervelkolom wordt verwerkt en bilaterale dwars processen worden blootgesteld.
- Gebruik een Noyes Spring Scissor om de rugwervel kolom voorzichtig te openen en schakel vervolgens over naar een Friedman-Pearson Rongeur om de wervel botten te verwijderen om het ruggenmerg te blootstellen met intacte spinale zenuwen bevestigd.
- Voorzichtig ontleden ipsilaterale en contralaterale lumbale DRG (L4/L5 DRG in onze studie) en plaats het in 1 ml ijskoude CA+ +/mg+ +-gratis 1x HBSS in een dounce weefselhomogenisator. Nu zijn de weefsels klaar voor stap 2.
Opmerking: Trim de spinale zenuw bevestigd aan de DRG indien mogelijk.
2. Isoleer enkele cellen van de muis lumbale DRG
- Homogeniseren het DRG-weefsel met een losse stamper in de Dounce-homogenisator 20-25 keer.
- Plaats een steriele 70 μm nylon celzeef in een steriele 50 mL conische buis. Bevochtig de celzeef met 800 μL ijskoud 1x HBSS, en de doorstroom wordt opgevangen in de conische buis.
- Verzamel de gehomogeniseerde weefsel suspensie van de homogenisator met behulp van een pipet en doorloop de natte 70 μm nylon celzeef in de conische buis van 50 mL.
- Spoel de homogenisator tweemaal met 800 μL ijskoud 1x HBSS en giet vervolgens in dezelfde conische buis van 50 mL met celzeef om de opbrengst te verhogen.
- Voeg 1,5 ml van het geëquilibreerd ijskoude isotone dichtheidsgradiënt (bereid in stap 1,1) toe in een steriele 5-ml polystyreen FACS buis.
- Breng de cel homogenaat van de 50 mL conische buis (in stap 2,4) in de FACS buis, meng goed met het dichtheidsgradiënt medium door pipetteren op en neer. Voeg een extra 500 μL van 1x HBSS toe om de bovenkant te verzegelen.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 800 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c.
- Zuig voorzichtig het supernatant met myeline in het medium op zonder de celpellet aan de onderkant van de FACS Tube te verstoren.
- Respendeer de cellen in PBS-of FACS-buffer met 5% foetaal runderserum (FBS) voor FACS-analyse.
Opmerking: ten minste 50.000 tot 100.000 cellen worden verwacht van L4/L5 DRG van één muis.- Rebreng de mechanisch geïsoleerde DRG cellen (L4/L5) in 100 μL PBS met 5% foetaal runderserum en inbroed vervolgens met α-muis CX3CR1-APC antilichamen (1:2000) in het donker bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Was de cellen eenmaal met 5 mL PBS; Centrifugeer de cellen 360 x g gedurende 8 minuten bij 4 °c.
- Zuig de supernatant op en breng de celpellet in 300 μL PBS voor FCAS-analyse. Als het sorteren van cellen is gepland, wordt de cel in de FACS-buffer hervat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de geïsoleerde cellen te valideren, kozen we eerst voor de macrophage FAS-geïnduceerde apoptosis (MAFFIA) transgene muizen17. Deze lijn drukt een drug-inducible FK506-bindend eiwit (FKBP)-FAS Suicide Fusion gen en groene fluorescerende proteïne (eGFP) onder de controle van de promotor van CSF1 receptor (CSF1R), die specifiek wordt uitgedrukt in zowel macrofagen en Microglia. Systemische injectie van FK-bindende proteïne dimerizer, AP20187 (AP), induceert de apoptosis van de cellen die het transgen uitdrukken. De uitdrukking van EGFP stelt ons ook in staat om de macrofagen in de DRG te monitoren. Om macrofagen in de MAFFIA muizen uit te putten, begonnen we onze studies met 3 dagelijkse intraperitoneale injecties met AP (1 mg/kg). Na de laatste injectie werden DRG gesectioneerd voor immunokleuring voor GFP. We registreerden een significant verlies van GFP+ cellen in het DRG van de met AP behandelde muizen in vergelijking met veh behandelde muizen (Figuur 1a-B). In een afzonderlijk experiment gebruikten we dit protocol om de DRG-macrofagen mechanisch te ontkoppelen na de behandeling. De daaropvolgende FACS analyse toonde een succesvolle uitputting van de GFPHi populatie in met AP behandelde muizen (Figuur 1C-D) en demonstreerde de hoge kwaliteit van geïsoleerde cellen.
We kenmerkten ook de geïsoleerde DRG cellen van de wild-type muizen. Mechanisch geïsoleerde DRG cellen (L4/L5) werden bevlekt met α-muis CX3CR1-APC antilichamen. We constateerden dat 6% van de DRG-cellen CX3CR1+ macrofagen (Figuur 2A-B) waren. De levensvatbaarheid van de cellen werd ook beoordeeld met Propidium jodide (eindconcentratie van 2,5 μg/ml) die bindt aan het intracellulaire DNA van de niet-levensvatbare cellen, waaruit blijkt dat meer dan 80% van de vers geïsoleerde DRG cellen levensvatbaar waren (Figuur 2C-D).
Figuur 1: FACS analyse van macrofagen in de DRG van MAFFIA muizen na AP behandeling.
MAFFIA muizen kregen 3 dagen vóór de analyse dagelijks een intraperitoneale injectie van 1 mg/kg AP20187 (AP) of een voertuig (VEH). (a, B) Representatieve immunokleurings beelden die de door de AP veroorzaakte uitputting van GFP+ (groene) macrofagen in de L4/L5 DRG na de behandeling met 3RD AP aantonen. NF200 (blauw) werd gebruikt om myelgefluoreerde neuronen te labelen. Schaal: 50 μm. (C, D) De percentages CSF1R-GFPHi cellen na mechanische dissociatie van de L4/5 DRG werd bepaald door FACS analyse, en een representatieve gegevensset van drie onafhankelijke experimenten wordt getoond met het percentage van de gated celpopulatie aangegeven. Het resultaat toont aan dat 4% van de totale geïsoleerde cellen van het DRG van VEH behandelde dier GFPHi macrofagen was. Daarentegen was slechts 0,4% van de totale DRG-cellen GFPHi macrofagen in AP-behandelde muis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: FACS karakterisering van macrofagen in het DRG van de wild-type muizen.
(a, B) Ipsilaterale L4 en L5 DRG van de naïeve wild-type muis werden samengevoegd voor mechanische dissociatie. Het percentage CX3CR1+ macrofagen werd gemeten door FACS Analysis (A). De gating voor CX3CR1+ cellen was gebaseerd op de achtergrond fluorescentie in de cellen geïnineerd met APC-geconjugeerde Isotype controle antilichamen (B). (C, D) De levensvatbaarheid van de cel van vers geïsoleerde DRG cellen werd beoordeeld met Propidium Iodide (PI) kleuring. PI+ cellen (C) werden op basis van de achtergrond fluorescentie in de Onbevlekte cellen (D) gesloten. Een representatieve gegevensset van drie onafhankelijke experimenten wordt weergegeven met het percentage van de opgegeven gated celpopulatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier introduceren we een nieuwe methode om geïsoleerde macrofagen effectief te verrijken van muis DRG. De conventionele aanpak voor het isoleren van DRG-immuuncellen vereist enzymatische spijsvertering15,18, die nu wordt vervangen door mechanische homogenisatie in ons protocol om ongewenste celbeschadiging te beperken en de opbrengst te verhogen. Daarom is het nieuwe protocol veel minder tijdrovend. Wat nog belangrijker is, de enzym vertering kan de macrofagen stimuleren en de moleculaire handtekening veranderen. In tegenstelling, onze mechanische aanpak sterk beperkt cellulaire stress.
Met behulp van FACS analyse, we verder gekenmerkt de macrofagen in de geïsoleerde DRG cellen en toonde een grote cellulaire herstel. Meer dan 80% van geïsoleerde DRG cellen onder dit protocol bleken levensvatbaar te zijn (figuur 2D). Ten minste 50.000 tot 100.000 cellen worden verwacht van L4/L5 DRG van één muis. Daarom kunnen we met vertrouwen concluderen dat de DRG-cellen verder kunnen worden gesorteerd in macrofaag-subpopulaties14 voor zowel cultuur-als RNA-isolatie. Er zijn echter een paar kritische stappen die van invloed kunnen zijn op de opbrengst. Als de onbevredigende celopbrengst wordt opgemerkt, moet de ontoereikende of buitensporige homogenisatie in stap 2,1 worden vermoed. De mate van celdood beoordeeld met PI (Figuur 2) of 7-Aad-kleuring kan worden gebruikt om het protocol te optimaliseren. Bovendien, DRG dissectie in stap 1,4 kan herhaalde oefening voor beginners vereisen.
Momenteel gebruikt ons lab voornamelijk dit protocol voor het bestuderen van de DRG macrofagen. Waarschijnlijk kan de toepassing van dit protocol worden uitgebreid om andere niet-neuronale cellen in de DRG te bestuderen, zoals satelliet cellen19en T-cellen20. Verdere studies zijn nodig om de effectiviteit van de celisolatie te bevestigen. Helaas, onze huidige mechanische dissociatie methode is niet ideaal voor isolatie van DRG sensorische neuronen, en enzymatische spijsvertering blijft de meest effectieve methode voor sensorische neuron isolatie15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen met betrekking tot dit manuscript.
Acknowledgments
De studie werd gesteund door: Stichting voor anesthesie onderwijs en onderzoek (XY); de afdeling van de UCSF anesthesie en perioperatieve zorg (XY); en 1R01NS100801-01 (GZ). Deze studie werd deels ondersteund door het HDFCCC-laboratorium voor de gedeelde bronnen faciliteit voor Celanalyse door middel van een subsidie van de NIH (P30CA082103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
