Summary
Ici nous présentons un protocole mécanique de dissociation pour isoler rapidement des macrophages du ganglion de racine dorsal pour le phénotypage et l'analyse fonctionnelle.
Abstract
Il y a des intérêts croissants pour étudier les interactions moléculaires et cellulaires entre les cellules immunitaires et les neurones sensoriels dans les ganglions de racine dorsal après des dommages périphériques de nerf. Les cellules monocytiques périphériques, y compris les macrophages, sont connues pour répondre à une lésion tissulaire par phagocytose, présentation d'antigène, et libération de cytokine. Les preuves émergentes ont impliqué la contribution des macrophages de ganglions de racine dorsale au développement neuropathique de douleur et à la réparation axonale dans le contexte des dommages de nerf. Le phénotypage rapide (ou « isolement rapide de ») la réponse des macrophages de ganglions de racine dorsal dans le contexte des dommages de nerf est désirée pour identifier les facteurs neuroimmuns inconnus. Ici, nous démontrons comment notre laboratoire isole rapidement et efficacement les macrophages des ganglions de racine dorsal à l'aide d'un protocole de dissociation mécanique sans enzymes. Les échantillons sont conservés sur la glace tout au long pour limiter le stress cellulaire. Ce protocole prend beaucoup moins de temps que le protocole enzymatique standard et a été couramment utilisé pour notre analyse de tri cellulaire activée par fluorescence.
Introduction
Il existe maintenant des preuves considérables que les cellules immunitaires contribuent à la douleur neuropathique suite à une lésion nerveuse périphérique1,2. Les cellules monocytiques périphériques, y compris les macrophages mûrs, sont connues pour répondre aux dommages de tissu et à l'infection systémique par la phagocytose, la présentation d'antigène, et la libération de cytokine. Parallèlement à l'activation des microglies induites par les lésions nerveuses dans la corne dorsal spinale, les macrophages dans les ganglions de racine dorsal (DRG) se développent également de manière significative après des dommages de nerf3,4. Notamment, il y a des intérêts croissants pour déterminer si les macrophages contribuent au développement neuropathique de douleur après la blessure périphérique de nerf en interagissant avec des neurones sensoriels dans le DRG5,6,7, 8 Annonces , 9 (en) , 10 Ans et plus , 11. En outre, des études récentes impliquent également la contribution des macrophages de DRG dans la réparation axonale après des dommages de nerf12,13. Une autre étude suggère en outre que les sous-populations de macrophages (c.-à-d. CD11b-Ly6Csalut et CD11b-Ly6Cfaible /- cellules) peuvent jouer un rôle différent dans l'hypersensibilité mécanique14. Par conséquent, le phénotypage rapide de la réponse des macrophages de DRG dans le contexte des dommages de nerf peut nous aider à identifier des facteurs neuroimmuns contribuant à la douleur neuropathique.
Conventionnellement, le protocole pour isoler les macrophages dans le DRG implique plusieurs étapes, y compris la digestion enzymatique15,16. La technique prend souvent beaucoup de temps et peut être coûteuse pour des expériences à grande échelle. Bien que la digestion douce avec le type II de collagène (4 mg/mL) et le type de dispase II (4.7 mg/mL) pendant 20 min ait été recommandée précédemment15,il est concevable que les cellules après l'exposition à cette enzyme soient sujettes aux dommages cellulaires ou à la mort cellulaire, qui peuvent mener à de bas produire. En outre, la différence dans la qualité des enzymes d'un lot à l'autre peut avoir un impact supplémentaire sur l'efficacité de ce processus. Plus important encore, les macrophages exposés à la digestion enzymatique pourraient être stimulés de façon irréprossable et peuvent donc être très différents du statut in vivo. Les changements peuvent potentiellement compliquer les résultats de l'étude fonctionnelle.
Ici nous décrivons un protocole enzyme-libre pour isoler rapidement des macrophages de DRG à 4 oC utilisant la dissociation mécanique. Les échantillons sont conservés sur la glace pour limiter le stress cellulaire. En conséquence, notre approche fournit un avantage pour maintenir la cohérence de l'isolement, et les cellules isolées sont probablement plus saines et moins stimulées. Nous présentons en outre les preuves pour valider la qualité des cellules isolées avec l'analyse de tri cellulaire activée par fluorescence (FACS).
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Californie à San Francisco et ont été menées conformément au Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Recueillir d'autres DRG lombaires à partir de souris expérimentales
- Avant de commencer l'expérience, préparez la solution de travail du milieu de gradient de densité (par exemple, Percoll) en mélangeant 9 volumes du milieu avec 1 volume de Ca/Mg- sans 10x HBSS. Gardez-le sur la glace.
- Anesthésiez la souris avec 2,5% D'Avertin. Confirmez que l'animal est entièrement anesthésié par l'absence de réponse à la pince de patte arrière.
REMARQUE: Des souris mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées. - Perfil la souris transcardialement avec 10 ml de 1x PBS pré-réfrigéré.
- Placez la souris en position de supine avec quatre pattes fixées avec le ruban adhésif à l'intérieur d'une hotte de fumée chimique. Soulevez la peau sous la cage thoracique par les forceps, et faites une petite incision avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer le foie et le diaphragme.
- Continuer à utiliser des ciseaux pour couper le diaphragme et la cage thoracique, ouvrir la cavité pleurale pour exposer le cœur battant.
- Coupez rapidement l'appendice auriculaire droit avec des ciseaux d'iris. Une fois que le saignement est noté, insérez une aiguille de 30 G dans l'extrémité postérieure du ventricule gauche, et injectez lentement 10 ml de 1x PBS pré-réfrigéré pour perfuser l'animal.
- Effectuer lalactomie dorsal15 sur la souris placée à la position couchée.
REMARQUE : Si la culture cellulaire est planifiée, vaporisez la souris avec 70 % d'éthanol avant l'incision et utilisez des instruments chirurgicaux pré-stérilisés pour la dissection.- Utilisez un scalpel de taille 11 pour faire une incision latérale longitudinale profonde à partir de la région thoracique jusqu'à la région sacrée. Enlever la peau par les ciseaux pour exposer la couche musculaire dorsal.
- Utilisez Friedman-Pearson Rongeur pour décoller les tissus conjonctifs et les muscles jusqu'à ce que les processus de la colonne vertébrale lumbosacrale et les processus transversaux bilatéraux soient exposés.
- Utilisez un ciseaux de ressort Noyes pour ouvrir soigneusement la colonne vertébrale dorsale, puis passez à un Rongeur Friedman-Pearson pour enlever les os vertébraux pour exposer la moelle épinière avec les nerfs rachidiens intacts attachés.
- Disséquez soigneusement le DRG lombaire ipsilatéral et contralatéral (L4/L5 DRG dans notre étude)et placez-le dans 1 ml de Ca glacé-/Mg-sans 1x HBSS dans un homogénéisateur de tissu de Dounce. Maintenant, les tissus sont prêts pour l'étape 2.
REMARQUE : Couper le nerf spinal attaché au DRG si possible.
2. Isoler les cellules simples de la souris lombaire DRG
- Homogérisez le tissu DRG avec un pilon lâche dans l'homogénéisateur Dounce 20-25 fois.
- Placer une passoire stérile à cellules de nylon de 70 m dans un tube conique stérile de 50 ml. Mouillez la passoire cellulaire avec 800 l de 1x HBSS à froid, et l'écoulement est recueilli dans le tube conique.
- Recueillir la suspension de tissu homogénéisé de l'homogénéisateur à l'aide d'une pipette et passer à travers la passoire humide de 70 m en nylon dans le tube conique de 50 ml.
- Rincer l'homogénéisateur deux fois avec 800 l de 1x HBSS glacé, puis décander dans le même tube conique de 50 ml avec une passoire cellulaire pour augmenter le rendement.
- Ajouter 1,5 ml de milieu de gradient isotonique de densité isotonique glace-froid récalcitré (préparé à l'étape 1.1) dans un tube stérile de 5 ml de polystyrène FACS.
- Transférer l'homogénéité cellulaire du tube conique de 50 ml (à l'étape 2.4) dans le tube FACS, bien mélanger avec le milieu de gradient de densité par pipetting de haut en bas. Ajouter 500 l de 1x HBSS supplémentaires pour sceller le dessus.
- Pelleter les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 20 min à 4 oC.
- Aspirez soigneusement le supernatant contenant de la myéline dans le milieu sans déranger la pastille cellulaire au fond du tube FACS.
- Resuspendre les cellules dans le tampon PBS ou FACS contenant 5% de sérum bovin fœtal (FBS) pour l'analyse FACS.
REMARQUE : Au moins 50 000 à 100 000 cellules sont attendues de L4 /L5 DRG d'une souris.- Resuspendre les cellules DRG isolées mécaniquement (L4/L5) dans 100 OL de PBS contenant 5 % de sérum bovin fœtal, puis couver avec un anticorps CX3CR1-APC (1:2 000) dans l'obscurité à 4 oC pour 1 h.
- Laver les cellules avec 5 ml de PBS une fois; centrifugeuse des cellules 360 x g pendant 8 min à 4 oC.
- Aspirez le supernatant, puis suspendez la pastille cellulaire en 300 L de PBS pour l'analyse FCAS. Si le tri cellulaire est planifié, resuspendre les cellules dans le tampon FACS à la place.
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Representative Results
Pour valider les cellules isolées, nous avons d'abord choisi les souris transgéniques Macrophage Fas-Induced Apoptosis (MAFIA)17. Cette ligne exprime un gène de fusion de suicide FK506-Fas inductible de drogue-inductible (FKBP)-Fas et protéine fluorescente verte (eGFP) sous le contrôle du promoteur du récepteur CSF1 (CSF1R), qui est spécifiquement exprimé dans les macrophages et les microglies. L'injection systémique du dimerizer de protéine FK-contraignant, AP20187 (AP), induit l'apoptosis des cellules exprimant le transgène. L'expression de l'EGFP nous permet également de surveiller les macrophages dans le DRG. Pour épuiser les macrophages chez les souris MAFIA, nous avons commencé nos études avec 3 injections intrapéritones quotidiennes d'AP (1 mg/kg). Après la dernière injection, DRG ont été sectionnés pour immunostaining pour GFP. Nous avons enregistré une perte significative de cellules GFPdans le DRG des souris traitées par AP par rapport aux souris traitées par VEH(figure 1A-B). Dans une expérience distincte, nous avons utilisé ce protocole pour dissocier mécaniquement les macrophages DRG après le traitement. L'analyse suivante de FACS a indiqué un appauvrissement réussi de la population desalut de GFP dans les souris AP-traitées (figure 1C-D) et a démontré la haute qualité des cellules isolées.
Nous avons également caractérisé les cellules DRG isolées des souris de type sauvage. Des cellules d'AGR mécaniquement isolées (L4/L5) ont été souillées avec l'anticorps CX3CR1-APC de souris. Nous avons constaté que 6 % des cellules DRG étaient des macrophages CX3CR1(figure 2A-B). La viabilité cellulaire a également été évaluée à l'aide de Propidium Iodide (concentration finale de 2,5 g/ml) qui se lie à l'ADN intracellulaire des cellules non viables, ce qui révèle que plus de 80 % des cellules DRG fraîchement isolées étaient viables(figure 2C-D).
Figure 1 : Analyse FACS des macrophages dans le DRG des souris de MAFIA après traitement d'AP.
Les souris DE LA MAFIA ont reçu une injection intrapéritonéale quotidienne de 1 mg/kg d'AP20187 (AP) ou de véhicule (VEH) pendant 3 jours avant l'analyse. (A, B) Images immunostaining représentatives montrant l'épuisement AP-induit des macrophages(verts) dans le DRG de L4/L5 après le traitement de3ème AP. NF200 (bleu) a été utilisé pour étiqueter les neurones myélinisés. Barre d'échelle: 50 m. (C, D) Le pourcentage de cellulesHi CSF1R-GFP après la dissociation mécanique du DRG L4/5 a été déterminé par l'analyse FACS, et un ensemble de données représentatifs de trois expériences indépendantes est montré avec le pourcentage de la population de cellules fermées indiqué. Le résultat montre que 4% du total des cellules isolées de la DRG de l'animal VEH-traité étaient des macrophages desalut de GFP. En revanche, seulement 0,4% des cellules totales de DRG étaient des macrophages de salut de GFP dans la souris AP-traitée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Caractérisation fac-féminine des macrophages dans le DRG des souris de type sauvage.
(A, B) Ipsilateral L4 et L5 DRG de souris sauvages naïves de type sauvage ont été mis en commun pour la dissociation mécanique. Le pourcentage de macrophages CX3CR1et macrophages ont été mesurés par l'analyse FACS (A). Le gating pour les cellules CX3CR1était basé sur la fluorescence de fond dans les cellules incubées avec l'anticorps de contrôle d'isotype APC-conjugué (B). (C, D) La viabilité cellulaire des cellules DRG fraîchement isolées a été évaluée à l'adresse Propidium Iodide (PI). PI- cellules (C) ont été fermées en fonction de la fluorescence de fond dans les cellules non tachées (D). Un ensemble de données représentatifs de trois expériences indépendantes est montré avec le pourcentage de la population de cellules fermées indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous introduisons une nouvelle méthode pour enrichir efficacement les macrophages isolés de la souris DRG. L'approche conventionnelle pour isoler les cellules immunitaires DRG nécessite une digestion enzymatique15,18, qui est maintenant remplacé par l'homogénéisation mécanique dans notre protocole pour limiter les dommages cellulaires indésirables et augmenter le rendement. Par conséquent, le nouveau protocole prend beaucoup moins de temps. Plus important encore, la digestion enzymatique pourrait stimuler les macrophages et changer la signature moléculaire. En revanche, notre approche mécanique limite considérablement le stress cellulaire.
Utilisant l'analyse de FACS, nous avons en outre caractérisé les macrophages dans les cellules d'Isolement de DRG et avons démontré une grande récupération cellulaire. Plus de 80 % des cellules DRG isolées en vertu de ce protocole se sont avérées viables (Figure 2D). Au moins 50.000 à 100.000 cellules sont attendues de L4 /L5 DRG d'une souris. Par conséquent, nous pouvons conclure avec confiance que les cellules DRG peuvent être plus loin triées en sous-populations de macrophages14 pour la culture ou l'isolement d'ARN. Cependant, il y a quelques étapes critiques qui peuvent avoir un impact sur le rendement. Si le rendement cellulaire insatisfaisant est noté, l'homogénéisation insuffisante ou excessive à l'étape 2.1 devrait être suspectée. L'étendue de la mort cellulaire évaluée avec PI (figure 2) ou 7-AAD coloration peut être utilisé pour optimiser le protocole. En outre, dissection DRG dans l'étape 1.4 peut nécessiter une pratique répétée pour les débutants.
Actuellement, notre laboratoire utilise principalement ce protocole pour étudier les macrophages DRG. Probablement, l'application de ce protocole peut être étendue pour étudier d'autres cellules non-neuronales dans le DRG, tels que les cellules satellites19, et les cellules T20. D'autres études sont nécessaires pour confirmer l'efficacité de l'isolement cellulaire. Malheureusement, notre méthode de dissociation mécanique actuelle n'est pas idéale pour l'isolement des neurones sensoriels DRG, et la digestion enzymatique reste la méthode la plus efficace pour l'isolement sensoriel de neurone15.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent lié à ce manuscrit.
Acknowledgments
L'étude a été soutenue par : Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); le Département d'anesthésie et de soins périopératoires de l'UCSF (XY); et 1R01NS100801-01(GZ). Cette étude a été appuyée en partie par le Laboratoire d'analyse cellulaire des ressources partagées du CCSDHc grâce à une subvention des NIH (P30CA082103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
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