キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ
Summary
このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus laevis胚の眼芽にマイクロインジェクションする方法、およびテクター中脳における視神経軸軸樹園を発現する個々の緑色蛍光タンパク質(GFP)を画像化して再構築する方法を示すことを目的としています。無傷で、生きているキセノプスオタマジャクシ。
Abstract
水生カエルXenopus laevisのオタマジャクシの主な視覚投影は、神経結合の発達を調節するメカニズムを研究するための優れたモデルシステムとして機能する。レティノテクター投影の確立の間、光学軸が目から伸び、彼らの標的組織、視体に到達するために脳の異なる領域をナビゲートする。光学軸がテクタムに入ると、彼らはテクタム内のターゲットインターニューロンで行うことができるシナプス接続の数を増やすために機能するターミナルアーバーを精巧に作ります。ここでは、キセノプス胚における光ニューロン(再生神経節細胞)において、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAを発現する方法と、機能低下遺伝子構築物を発現する方法について述べる。1日齢の胚の眼帯にDNA/リポフェクション試薬をマイクロインジェクションし、外因性遺伝子を単一または少数の光学ニューロンで発現させる方法について説明する。遺伝子をGFPでタグ付けするか、GFPプラスミドと共に注入することにより、分子シグナル伝達を変化させた個々の光学ニューロンの末端軸索アーバーは、数日後に生きているXenopusオタマジャクシとその形態をそのままの脳に直接画像化することができる。定量化できます。このプロトコルは、生体内の光学軸ゾン樹木化の開発の根本にある細胞自律分子機構の決定を可能にする。
Introduction
神経系の発達中に、シナプス前ニューロンの軸は、彼らのターゲット領域に到達するために脳の多様な領域をナビゲートします。軸が標的組織に侵入すると、シナプス標的ニューロンとのシナプス結合を確立します。多くの種類のニューロンでは、軸が端子分岐またはアーバー1のネットワークを詳述することによって行うことができるシナプス接続の数と空間範囲を増加させます。水生カエルXenopus laevisのオタマジャクシの網状粘薬投影は、末端軸ゾンの樹木化とシナプス接続性2、3、4の基礎となるメカニズムを調べるための強力な脊椎動物モデルです。.正常および変化した分子シグナル伝達を有する視神経軸軸アーバーを発現する個々のGFPは、無傷で直接観察することができ、生きているキセノプスオタマジャクシ5、6、7、8。少数の光学ニューロンで遺伝子の全長または切り捨てバージョンと一緒にGFPを単独で表現するために、我々は1日古いXenopus胚9の眼帯にDNAのマイクロインジェクション/リポフェクションを含む技術を使用し、10.この技術は、もともと若いキセノプスオタマジャクシにおけるオプティック軸線の経路発見のメカニズムを研究するために開発されたもので、それ以来、光学軸ゴンの基礎となる細胞自律分子機構を決定するために私たちや他の人によって適用されています。キセノプスオタマジャクシ5、6、7、8、9、10のアーボライゼーション。
少数の光学ニューロンで外因性遺伝子を発現させる代替技術は、他のモデル種、ならびにX.laevisで開発されている。しかし、これらのアプローチのそれぞれは、キセノプス胚の眼帯におけるDNA/リポフェクション試薬のマイクロインジェクションと比較した場合の課題と限界を提示する。マウスでは、トランスジェネシスは少数の光学ニューロンで遺伝子を発現するために使用することができるが、トランスジェニックマウスの生成は、多くの場合、望ましくない副作用を有する高価かつ時間がかかり、トランスジェニックマウスが存在する。視神経ニューロンで外因性遺伝子を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、初期切断段階胚12にプラスミドを注入することによっても作成することができる。しかし、このプロセスは、ゼブラフィッシュ幼虫12の光学ニューロンにおけるモザイクパターンで遺伝子を発現する特定のプロモーターのクローニングを必要とする。トランスジェニックゼブラフィッシュにおける視細胞ニューロンにおける外因性DNAの発現頻度もやや低い(<30%)DNA/リポソーム試薬をマイクロ注入したキセノプスオタマジャクシと比較して(30−60%)12.ovoエレクトロポレーションでは、ひよこ13の少数の光学ニューロンで遺伝子を発現するためにも使用されている。しかし、この手順は、光学軸ゾンの植樹は、生きているひよこ胚をそのままに画像化することができないため、光学投影を確立するメカニズムを完全に特徴付けることができなかった。最後に、いくつかの研究室は、Xenopusオタマジャクシ14、15の少数の光学ニューロンに遺伝子をトランスフェクトするためにエレクトロポレーションを使用しています。しかし、エレクトロポレーションは、DNA/リポフェクション試薬をXenopus胚の眼芽にマイクロインジェクションするために使用される以上の装置とプロトコル(刺激器、電極、空間および時間的パターン)の最適化を必要とします。
我々らは以前、Xenopus胚の眼帯にDNAのマイクロインジェクション/リポフェクションの技術を使用して、光軸ゾン樹盤化5、6を確立する細胞自律シグナル伝達機構を決定した。7,8.我々は当初、キセノプスオタマジャクシ5、6における視薬軸樹園におけるカドヘリンおよびWntアダプタータンパク質β-カテニンの機能を解剖するためにこのアプローチを用いた。ある研究では、β-カテニンとPDZへの結合が、それぞれ生体内の視軸樹園を始め、形成するために必要であることを示した。第2の報告では、α-カテニンおよびGSK-3βに対するβ-カテニン結合ドメインが、腹部視軸軸樹園6の突起パターンを逆に調節することを実証した。さらに最近では、Xenopusオタマジャクシ7における視薬軸樹園の形態学的特徴を調節する際に、Wnt因子、腺腫性ポリポシス大腸菌(APC)の役割を同定した。β-カテニン安定性および微小管組織を個々の光学ニューロンにおけるGFPと共に調節するAPCのN末端および中央ドメインを共発現することにより、これらのAPC相互作用ドメインの共有および明確な役割を分岐数で決定し、長さ、および生体内7の光学軸軸のアーバーの角度。別の実験室では、ブセノプスオタマジャクシ8の光学軸軸樹園におけるBDNF受容体TrkBによるシグナル伝達のための細胞自律的役割を決定するために、マイクロインジェクション/リポフェクション技術を使用した。この群は、生体内8における個々の光学軸軸高アーバーにおける優勢陰性TrkB摂動およびシナプス成熟の発現を示した。全体的に、Xenopusの脂肪形成技術は、すでにネイティブ環境における視認軸分岐における異なる遺伝子の特定の役割を明らかにしている。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、単一または少数の光学ニューロンで外因性DNA構築物を発現する方法と、カエルXの生きているオタマジャクシをそのまま正常かつ変化した分子シグナル伝達で視体軸軸アーバーを発現する個々のGFPを画像化する方法を示す。 .ラエビス.また、生体内で撮影した画像から光学軸軸アーバーを発現するGFPの形態を再構築・定量化する方法についても説明する。少数の光学ニューロ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの研究を支援してくださったトゥーロ大学カリフォルニア大学オステオパシー医学カレッジに感謝します。私たちは、研究室でこのマイクロインジェクション技術を実装するのを助けた研究室の前の学生(エスター・ウー、グレゴリー・ペン、テグン・ジン、ジョン・リム)を認めます。私たちは、ゼノプス胚のこのDNAマイクロインジェクション/リポフェクション技術が最初に開発された研究室で、クリスティン・ホルト博士に感謝しています。
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
Riferimenti
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