Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos
Summary
Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.
Abstract
La proyección visual primaria de renacuajos de la rana acuática Xenopus laevis sirve como un excelente sistema modelo para el estudio de mecanismos que regulan el desarrollo de la conectividad neuronal. Durante el establecimiento de la proyección retino-tectal, los axónicos ópticos se extienden desde el ojo y navegan a través de regiones distintas del cerebro para llegar a su tejido objetivo, el tectum óptico. Una vez que los axons ópticos entran en el tectum, elaboran árboles terminales que funcionan para aumentar el número de conexiones sinápticas que pueden hacer con las interneuronas objetivo en el tectum. Aquí, describimos un método para expresar la codificación del ADN de la proteína fluorescente verde (GFP), y construcciones genéticas de ganancia y pérdida de función, en neuronas ópticas (células ganglionares retinianas) en embriones de Xenopus. Explicamos cómo microinyectar un reactivo combinado de ADN/lipofección en los eyebudsdes de un día de edad, de modo que los genes exógenos se expresan en un solo o pequeño número de neuronas ópticas. Mediante el etiquetado de genes con GFP o co-inyección con un plásmido GFP, los árboles axonales terminales de neuronas ópticas individuales con señalización molecular alterada se pueden imaginar directamente en cerebros de renacuajos de Xenopus intactos y vivos varios días más tarde, y su morfología se puede cuantificar. Este protocolo permite la determinación de mecanismos moleculares autónomos celulares que subyacen al desarrollo de la arborización de axón óptico in vivo.
Introduction
Durante el desarrollo del sistema nervioso, axons de neuronas presinápticas navegan a través de diversas regiones del cerebro para llegar a sus áreas objetivo. Cuando los axons invaden sus tejidos diana, establecen conexiones sinápticas con las neuronas diana postsinápticas. En muchos tipos de neuronas, los axons aumentan el número y la extensión espacial de las conexiones sinápticas que pueden hacer mediante la elaboración de redes de ramas terminales o arbores1. La proyección retino-tectal de renacuajos de la rana acuática Xenopus laevis es un potente modelo de vertebrado para examinar los mecanismos subyacentes a la arborización terminal de axón y conectividad sináptica2,3,4 . Los árboles axonales ópticos individuales de expresión de GFP con señalización molecular normal y alterada se pueden observar directamente en renacuajos de Xenopus vivos5,6,7,8. Para expresar GFP solo o junto con versiones completas o truncadas de genes en un pequeño número de neuronas ópticas, utilizamos una técnica que implica microinyección/lipofección de ADN en los oculares de un día de edad Xenopus embriones9, 10. Esta técnica fue desarrollada originalmente para estudiar los mecanismos de búsqueda de trayectoria de axón óptico en los renacuajos del Xenopus jóvenes, y desde entonces ha sido aplicada por nosotros y otros para determinar los mecanismos moleculares autónomos de la célula subyacentes a la axón óptico arborización en renacuajos Xenopus 5,6,7,8,9,10.
Se han desarrollado técnicas alternativas para expresar genes exógenos en un pequeño número de neuronas ópticas en otras especies modelo, así como en X. laevis. Sin embargo, cada uno de estos enfoques presenta desafíos y limitaciones en comparación con la microinyección de REactivo de ADN/lipofección en los auriculares de embriones de Xenopus. En ratones, la transgénesis se puede utilizar para expresar genes en un pequeño número de neuronas ópticas, pero la generación de ratones transgénicos es costosa y consume mucho tiempo y ratones transgénicos a menudo presentan efectos secundarios indeseables11. El pez cebra transgénico que expresa genes exógenos en las neuronas ópticas también se puede crear inyectando plásmidos en embriones de etapa de escisión temprana12. Sin embargo, este proceso requiere la clonación de un promotor específico para expresar genes en un patrón de mosaico en neuronas ópticas en larvas de pez cebra12. La frecuencia de expresión del ADN exógeno en las neuronas ópticas en el pez cebra transgénico también es algo menor (<30%) en comparación con los renacuajos Xenopus que fueron microinyectados con ADN/reactivo liposomal (30-60%)12. En ovo electroporation también se ha utilizado para expresar genes en pequeños números de neuronas ópticas en polluelos13. Sin embargo, este procedimiento no ha caracterizado completamente los mecanismos que establecen proyecciones ópticas porque la arborización del axón óptico no se puede imaginar en embriones de polluelos vivos intactos. Por último, varios laboratorios han utilizado la electroporación para transfectar genes en un pequeño número de neuronas ópticas en Xenopus tadpoles14,15. Sin embargo, la electroporación requiere la optimización de equipos y protocolos (estimulador, electrodos, patrones espaciales y temporales de pulsos de onda) más allá de la utilizada para la microinyección de ADN/lipofección reactivo en los oculares de embriones Xenopus.
Nosotros y otros utilizamos anteriormente la técnica de microinyección/lipofección de ADN en los oculares de embriones Xenopus para determinar los mecanismos de señalización autónoma celular que establecen la arborización del axón óptico5,6, 7 , 8. Inicialmente utilizamos este enfoque para diseccionar las funciones de la proteína adaptadora de Cadherin y Wnt en la arborización óptica axonal en Xenopus tadpoles5,6. En un estudio, mostramos que se requiere la unión de la catenina a la catenina y a la PDZ, respectivamente, para iniciar y dar forma a los árboles axonales ópticos in vivo5. En un segundo informe, demostramos que los dominios de unión de catenina para la catenina y gSK-3o modulan de forma opuesta los patrones de proyección de los árboles axonales ventrales ópticos6. Más recientemente, identificamos roles para el factor Wnt, adenomatous poliposis coli (APC), en la regulación de las características morfológicas de los árboles axonales ópticos en Xenopus tadpoles7. Al co-expresar los dominios N-terminal y central de APC que modulan la estabilidad de la catenina y la organización del microtúbulos junto con la GFP en neuronas ópticas individuales, determinamos roles compartidos y distintos para estos dominios de interacción de APC en el número de rama, longitud, y el ángulo en los árboles axonales ópticos in vivo7. Otro laboratorio utilizó la técnica de microinyección/lipofección para determinar los roles autónomos celulares para la señalización por el receptor BDNF, TrkB, en los árboles axonales ópticos en xenopus renacuajos8. Este grupo mostró que la expresión de una ramificación dominante-negativa TrkB perturbado y maduración sináptica en los árboles de axón óptico individuales in vivo8. En general, la técnica de lipofección en Xenopus ya ha iluminado los roles específicos de diferentes genes en la ramificación de axón óptico en el entorno nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, demostramos cómo expresar construcciones de ADN exógeno en un solo o pequeño número de neuronas ópticas y cómo crear imágenes individuales de GFP que expresan árboles axonales ópticos con señalización molecular normal y alterada en renacuajos vivos intactos de la rana X . laevis. También explicamos cómo reconstruir y cuantificar la morfología de GFP expresando árboles axonales ópticos a partir de imágenes capturadas in vivo. Para expresar plásmidos de ADN exógenos en un pequ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Touro University California College of Osteopathic Medicine por apoyar nuestra investigación. Reconocemos a estudiantes anteriores en el laboratorio (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) que ayudaron a implementar esta técnica de microinyección en nuestro laboratorio. Agradecemos a la Dra. Christine Holt, en cuyo laboratorio se desarrolló por primera vez esta técnica de microinyección/lipofección de ADN en embriones de Xenopus.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
Riferimenti
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