Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları
Summary
Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.
Abstract
Su kurbağası Xenopus laevis iribaşlarının birincil görsel projeksiyonnöronal bağlanabilirlik gelişimini düzenleyen mekanizmaları incelemek için mükemmel bir model sistemi olarak hizmet vermektedir. Retino-tectal projeksiyonun kurulması sırasında optik aksonların gözden uzaması ve beynin farklı bölgelerinde niçin hedef dokuya, optik tektuma ulaşmasına yol açar. Optik aksonlar tektuma girdikten sonra, tektumdaki hedef internöronlarla yapabilecekleri sinaptik bağlantı sayısını artırmak için işlev gören terminal çardaklarını ayrıntıya sokarlar. Burada, Xenopus embriyolarında optik nöronlarda (retinal ganglion hücreleri) yeşil floresan protein (GFP) kodlayan DNA’yı ve fonksiyon kaybı ve kazanç ve fonksiyon kaybı gen yapılarını ifade etmek için bir yöntem tanımlıyoruz. Bir günlük embriyoların göz tomurcuklarına birleştirilmiş dna/lipofection reaktifinin nasıl mikro enjekte edileceğini açıklarız, bu şekilde eksojen genler tek veya az sayıda optik nöronla ifade edilir. GFP ile genleri etiketleme veya gfp plazmid ile birlikte enjekte ederek, değiştirilmiş moleküler sinyalile bireysel optik nöronların terminal aksonal arbors bozulmamış beyinlerde doğrudan görüntülenebilir, birkaç gün sonra yaşayan Xenopus iribaşlar, ve morfolojisi ölçülebilir. Bu protokol, in vivo optik akson arborization gelişiminin altında yatan hücre otonom moleküler mekanizmaların belirlenmesiiçin izin verir.
Introduction
Sinir sisteminin gelişimi sırasında, presinaptik nöronların aksonları hedef bölgelerine ulaşmak için beynin çeşitli bölgelerinde gezinmek. Aksonlar hedef dokularını istila ettiklerinde, postsinaptik hedef nöronlarla sinaptik bağlantılar kurarlar. Birçok nöron türünde aksonlar terminal dallarının veya çardakların ağlarını ayrıntılı bir şekilde detaylandırmak için yapabilecekleri sinaptik bağlantıların sayısını ve mekansal kapsamını arttırırlar1. Su kurbağası Xenopus laevis iribaşlarının retino-tectal projeksiyon terminal akson arborization ve sinaptik bağlantı2,3,4 altında yatan mekanizmaları incelemek için güçlü bir omurgalı modelidir . Normal ve değiştirilmiş moleküler sinyalile optik aksonal arbors ifade bireysel GFP bozulmamış doğrudan görülebilir, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları5,6,7,8. GFP’yi tek başına veya az sayıda optik nöronda genlerin tam uzunlukta veya kesilmiş versiyonlarıyla ifade etmek için, bir günlük Xenopus embriyolarının göz tomurcuklarına DNA’nın mikroenjeksiyon/lipofeksiyonunu içeren bir teknik kullanıyoruz9, 10– Bu teknik ilk olarak genç Xenopus kurbağalarında optik akson yol bulma mekanizmalarını incelemek için geliştirilmiştir ve o zamandan beri optik akson altında yatan hücre özerk moleküler mekanizmaları belirlemek için bize ve diğerleri tarafından uygulanmıştır Xenopus kurbağa yavruları nda ağaçlandırma5,6,7,8,9,10.
Optik nöronların az sayıda eksojen genleri ifade etmek için alternatif teknikler diğer model türler de geliştirilmiştir, yanı sıra X. laevis . Ancak, bu yaklaşımların her biri, Xenopus embriyolarının göz tomurcuklarında DNA/lipofection reaktifinin mikroenjeksiyonu ile karşılaştırıldığında zorluklar ve sınırlamalar sunmaktadır. Farelerde, transgenez optik nöronların az sayıda genleri ifade etmek için kullanılabilir, ancak transgenik farelerin üretimi pahalı ve zaman alıcı ve transgenik fareler genellikle istenmeyen yan etkileri ile mevcut11. Optik nöronlarda eksojen genleri ifade eden transgenik zebra balıkları da erken bölünme evre embriyolarına plazmid enjekte edilerek oluşturulabilir12. Ancak, bu süreç zebrabalığı larvaları optik nöronlarda bir mozaik desen genleri ifade etmek için belirli bir organizatörün klonlama gerektirir12. Transgenik zebra balıklarında optik nöronlarda ekzojen DNA ekspresyonu sıklığı da biraz daha düşüktür (<%30). DNA/lipozomal reaktif (%30−60) ile mikroenjekte edilen Xenopus kurbağa yavruları ile karşılaştırıldığında12. Ovo elektroporasyon da civciv optik nöronların az sayıda genleri ifade etmek için kullanılmıştır13. Ancak, optik akson arborization bozulmamış görüntülenemez, yaşayan civciv embriyolar çünkü bu prosedür optik projeksiyonlar kurmak mekanizmaları tam olarak karakterize etmek için başarısız oldu. Son olarak, birkaç laboratuvarxenopus kurbağa yavruları optik nöronlar az sayıda içine transfect genler için elektroporasyon kullandık14,15. Ancak, elektroporasyon ekipman ve protokollerin optimizasyonu gerektirir (uyarıcı, elektrotlar, dalga darbeleri mekansal ve zamansal desenler) ötesinde dna / lipofection reagent mikroenjeksiyon için kullanılan Xenopus embriyoların eyebuds içine.
Biz ve diğerleri daha önce optik aksonarborization5 kurmak hücre otonom sinyal mekanizmaları belirlemek için Xenopus embriyolarının eyebuds içine DNA mikroenjeksiyon / lipofection tekniği nikullandı5 ,6, 7.000 , 8– Biz başlangıçta Xenopus iribaşları optik aksonal arborization Cadherin ve Wnt adaptör protein β-catenin fonksiyonlarını incelemek için bu yaklaşımıkullandı5,6. Bir çalışmada, β-kateninα-catenin ve PDZ’ye bağlanmasının sırasıyla, in vivo5’teoptik aksonal arborların başlatılması ve şekillendirilmesi için gerekli olduğunu gösterdik. İkinci bir raporda, α-catenin ve GSK-3β için β-catenin bağlayıcı etki alanlarının ventral optik aksonal çarkların projeksiyon desenlerini zıt olarak modüle ettiğini gösterdik6. Daha yakın zamanda, Biz Wnt faktörü için roller tespit, adenomatöz polipozis coli (APC), Xenopus iribaşları optik aksonal arbors morfolojik özellikleri düzenleyen7. Β-catenin stabilitesini ve mikrotübül organizasyonunu bireysel optik nöronlarda GFP ile birlikte modüle eden APC’nin N-terminal ve merkezi etki alanlarını birlikte ifade ederek, şube numarası ndaki bu APC etkileşim etki alanları için ortak ve farklı roller belirledik, uzunluk ve in vivo7optik aksonal arbors açı . Başka bir laboratuvar, Xenopus iribaşları optik aksonal arbors bdnf reseptörü, TrkB, tarafından sinyal için hücre otonom rolleri belirlemek için mikroenjeksiyon / lipofection tekniği kullanılır8. Bu grup, vivo8yılında bireysel optik akson arbors bir baskın-negatif TrkB tedirgin dallanma ve sinaptik olgunlaşma ifade gösterdi. Genel olarak, Xenopus lipofection tekniği zaten yerli ortamda optik akson dallanma farklı genlerin belirli rolleri aydınlatılmış vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, tek veya az sayıda optik nöronda eksojen DNA yapılarının nasıl ifade edilebildiğini ve X kurbağasının yaşayan kurbağa yavrularında normal ve değiştirilmiş moleküler sinyallerle optik aksonal çardakları ifade eden gfp’nin nasıl görüntülenebileceğimizi gösteriyoruz. . laevis. Ayrıca, in vivo’da çekilen görüntülerden optik aksonal çardakları ifade eden GFP’nin morfolojisinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini ve ölçültebileceğimizi de açıklıyoruz. Az sayı…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz araştırma desteklemek için Touro Üniversitesi California Osteopatik Tıp Koleji teşekkür ederiz. Bu mikroenjeksiyon tekniğinin laboratuarımızda uygulanmasına yardımcı olan laboratuvardaki (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) önceki öğrencileri kabul ediyoruz. Dr. Christine Holt’a minnettarız, bu DNA mikroenjeksiyon/lipofection tekniği ilk olarak Xenopus embriyolarında geliştirildi.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
Riferimenti
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
