הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles
Summary
פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של קסנופוס
Abstract
ההקרנה החזותית העיקרית של טתרנים של הצפרדע הימית xenopus זריזה משמש מערכת מודל מעולה למחקר מנגנונים המסדירים את ההתפתחות של קישוריות עצבית. במהלך הקמתה של ההקרנה retino-tectal, מרחיבים אופטיים להאריך מן העין ולנווט באזורים שונים של המוח כדי להגיע רקמת היעד שלהם, tectal אופטי. לאחר אקסונים אופטיים להיכנס tectum, הם מורכבים סוכת הטרמינל כי הפונקציה להגדיל את מספר הקשרים סינפטית הם יכולים לעשות עם היעד interneurons ב tectum. כאן, אנו מתארים שיטה לבטא קידוד ה-DNA חלבון פלורסנט ירוק (GFP), ו-להשיג ואובדן של פונקציה מבנים גנים, ב נוירונים אופטיים (בתאי גנגליון הרשתית) ב העוברים Xenopus . אנו מסבירים כיצד להחדיר מיקרו DNA/ליפופיהזיהום מגיב לתוך eyebuds של עוברים הישן יום אחד כגון גנים אקסוגני מבוטא במספר יחיד או קטן של נוירונים אופטיים. על-ידי תיוג גנים עם gfp או שיתוף הזרקת עם gfp פלאבאמצע, הטרמינל סיבי סוכת של נוירונים בודדים אופטיים עם איתות מולקולרי שונה ניתן לדימות ישירות במוח של שלמים, חי xenopus ראשנים מספר ימים לאחר מכן, ואת מורפולוגיה שלהם ניתן לכמת. פרוטוקול זה מאפשר לקבוע את המנגנון המולקולרי האוטונומי התאי הנמצא בתוך הvivo.
Introduction
במהלך הפיתוח של מערכת העצבים, אקסונים של נוירונים טרום סינפטיות לנווט באזורים שונים של המוח כדי להגיע לאזורי היעד שלהם. כאשר אקסונים לפלוש רקמות היעד שלהם, הם לבסס קשרים סינפטית עם היעד הפוסט נוירונים. בסוגים רבים של נוירונים, אקסונים להגדיל את המספר ואת ההיקף המרחבי של חיבורי סינפטית הם יכולים לעשות על ידי הגברת רשתות של סניפי מסופים או סוכת1. ההקרנה retino-tectal של טתרנים של הצפרדע הימית xenopus זריזה הוא מודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור בדיקת מנגנונים בבסיס מסוף אקסון arborization קישוריות סינפטית2,3,4 . בודדים gfp ביטוי סוכת אופטיים עם איתות מולקולרי נורמלי ושונה ניתן לצפות ישירות בתוך שלמים, חי xenopus ראשנים5,6,7,8. כדי לבטא GFP בלבד או ביחד עם גירסאות באורך מלא או מקוצר של גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים, אנו משתמשים בטכניקה הכוללת מיקרוהזרקה/ליפופישל דנ א לתוך eyebuds של עוברי יום אחד עוברים9, 10. טכניקה זו פותחה במקור כדי לחקור מנגנונים של אקסון האופטי מציאת הצעיר xenopus tadpoles, והוא כבר הוחל על ידינו ואחרים כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים סלולריים בבסיס האקסון האופטי , הארבוריזציה בקספוס העמודים5,6,7,8,9,10
טכניקות חלופיות כדי לבטא גנים אקסוגני במספר קטן של נוירונים אופטיים פותחו במינים מודל אחרים, כמו גם ב -X זריזה. עם זאת, כל אחת מגישות אלה מציגה אתגרים ומגבלות בהשוואה למיקרו הזרקת דנ א/ליפופישל מגיב בeyebuds של עוברי קסנפוס . בעכברים, הטרנסגנזה יכולה לשמש כדי לבטא גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים, אבל הדור של עכברים טרנסגניים הוא יקר, עכברים הזמן לארוך ולעתים קרובות להציג עם תופעות לוואי לא רצויות11. בנוסף ניתן ליצור על ידי הזרקת פלסטלינה לתוך השלב המוקדםשל עוברימחשוף בעלי הצבע האופטי בנוירונים. עם זאת, תהליך זה דורש שיבוט של מיזם מסוים כדי לבטא גנים בתבנית פסיפס בנוירונים אופטיים בזחלים של דג הרימות12. תדירות הביטוי של דנ א אקסוגני בנוירונים אופטיים ב-דג זברה הוא גם נמוך במקצת (< 30%) שהיו מוזרקים באמצעות מגיב DNA/ליפוזומלי (30-60%) בשנת אלקטרופורציה שימש גם לבטא גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים באפרוחים13. עם זאת, הליך זה נכשל באפיון מלא של מנגנונים הקובעים הקרנות אופטיות, מכיוון שאין אפשרות ליצור תמונה של מנגנוני הראייה האופטיים ללא שינוי, עוברים בחורות חיות. בסופו של דבר, מספר מעבדות השתמשו באלקטרופורציה לגנים שונים למספר קטן של נוירונים אופטיים בקספוס טתרנים14,15. עם זאת, האלקטרופורציה דורשת אופטימיזציה של ציוד ופרוטוקולים (מלקחיים, אלקטרודות, דפוסים מרחביים ומרחבי של פולסים בגלי גל) מעבר לכך ששימשו להזרקות של דנ א/ליפופיציה מגיב לעיניים של עוברי קספוס .
אנחנו ואחרים בעבר השתמשנו בטכניקה של מיקרוהזרקה/ליפושל ה-DNA לתוך eyebuds של עוברי xenopus כדי לקבוע מנגנוני איתות אוטונומי האוטונומית הקמת אקסון אופטי5,6, מיכל סבן , 8. בתחילה השתמשנו בגישה זו כדי לנתח את הפונקציות של מתאם הקדהרין ו-wnt חלבון β-catenin בארבוריזציה אופטיתב- xenopus ראשנים עמודים 5,6. במחקר אחד, הראנו כי β-catenin קשירה ל α-catenin ו pdz נדרש, בהתאמה, עבור ייזום ועיצוב סוכת אופטיים בvivo5. בדו ח השני, הדגמנו כי התחומים β-catenin קשירה עבור α-catenin ו GSK-3β הקרנה לווסת את דפוסי ההקרנה של הפלבטים אופטיים הגחותיים6. לאחרונה, זיהינו תפקידים לגורם wnt, מאפייני פוליפוזיס coli (APC), בוויסות תכונות מורפולוגיות של סוכת אופטיים בתוך xenopus ראשנים7. על ידי שיתוף הביטוי את N-terminal ואת התחומים המרכזיים של APC לווסת יציבות β-catenin וארגון מיקרוכדורית יחד עם GFP בנוירונים בודדים אופטיים, החלטנו תפקידים משותפים וייחודיים עבור אלה תחומים האינטראקציה APC על מספר הסניף, אורך, וזווית בתוך סוכת אופטיים ב vivo7. מעבדה נוספת השתמשה בטכניקת המיקרוהזרקה/ליפוחות כדי לקבוע את תפקידי האוטונומית של התא עבור איתות על-ידי קולטן bdnf, trkb, ב-סיבי אופטיים ב- xenopus ראשנים8. קבוצה זו הראתה כי הביטוי של הסתעפות מודאג שלילי-TrkB המוני והתבגרות סינפטית בתוך האקסון האופטי הבודד ב vivo8. באופן כללי, טכניקת הליפיפוס ב- Xenopus כבר הרחיבה את התפקידים הספציפיים של גנים שונים בעלת הסתעפות אופטית בסביבה הטבעית.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לבטא במבנים DNA אקסוגני במספר יחיד או קטן של נוירונים אופטיים וכיצד התמונה בודדים gfp המבטא האופטית סוכת עם איתות רגיל ומשתנה מולקולרית בשלמותו, החיים ראשנים של הצפרדע X . . אני מבין. אנו גם מסבירים כיצד לשחזר ולכמת את המבנה של gfp המבטא האופטית סוכת מתמונות שנתפסו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Touro אוניברסיטת קליפורניה המכללה לרפואה אוסטאופתי על תמיכה במחקר שלנו. אנו מכירים את התלמידים הקודמים במעבדה (אסתר וו, גרגורי פנג, Taegun Jin, ג’ון סלים) שסייעו ליישם את טכניקת המיקרוהזרקה הזאת במעבדה שלנו. אנו אסירי תודה לד ר כריסטין הולט, שבמעבדאת הטכניקה הזאת, מיקרופיפוס ה-DNA וטכניקת הליפסד בעוברים התפתחו לראשונה.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
Riferimenti
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
