Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus
Summary
Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.
Abstract
A projeção Visual preliminar dos girinos da rã aquática Xenopus laevis sere como um sistema modelo excelente para estudar os mecanismos que regulam o desenvolvimento da conectividade neuronal. Durante o estabelecimento da projeção retino-tectal, os axônios óticos estendem do olho e navegam através das regiões distintas do cérebro para alcangar seu tecido do alvo, o Tectum ótico. Uma vez que os axônios óticos entram no Tectum, elaboram os mandris terminais que funcionam para aumentar o número de conexões sináptica que podem fazer com os interneurônios do alvo no Tectum. Aqui, nós descrevemos um método para expressar o ADN que codifica a proteína fluorescente verde (GFP), e o ganho-e construções do gene da perda–função, em neurônios óticos (pilhas retinal do gânglio) em embriões de Xenopus . Nós explicamos como microinjeção um reagente combinado do ADN/lipofection nos ocular de uns embriões velhos do dia tais que os genes exógenos são expressos no único ou em números pequenos de neurônios óticos. Marcando genes com GFP ou coinjetando com um plasmídeo de GFP, os mandris axonal terminais de neurônios óticos individuais com sinalização molecular alterada podem ser imaged diretamente nos cérebros de girinos intactos, vivos de Xenopus diversos dias mais tarde, e sua morfologia pode ser quantificada. Este protocolo permite a determinação de mecanismos moleculares Cell-Autonomous que fundamentam o desenvolvimento do arborização ótico do AXON in vivo.
Introduction
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, axônios de neurônios pré-sinápticos navegar através de diversas regiões do cérebro para alcançar suas áreas-alvo. Quando os axônios invadem seus tecidos-alvo, eles estabelecem conexões sinápticas com neurônios-alvo pós-sinápticos. Em muitos tipos de neurônios, os axônios aumentam o número e a extensão espacial das conexões sinápticas que eles podem fazer elaborando redes de ramos terminais ou mandris1. A projeção retino-tectal de girinos da rã aquática Xenopus laevis é um poderoso modelo de vertebrados para o exame de mecanismos subjacentes à arborização do AXON terminal e à conectividade sináptica2,3,4 . O GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada pode ser observado diretamente em girinos intactos, vivos de Xenopus 5,6,7,8. Para expressar a GFP isoladamente ou em conjunto com versões completas ou truncadas de genes em pequeno número de neurônios ópticos, utilizamos uma técnica envolvendo microinjeção/lipofection de DNA em oculares de embriões de um dia de idade Xenopus 9, a técnica 10. this foi desenvolvida originalmente para estudar mecanismos do pathfinding ótico do AXON em Tadpoles novos de Xenopus , e tem sido aplicada desde que nós e outro para determinar os mecanismos moleculars pilha-autônomos que subjacentes o AXON ótico arborização em Xenopus girinos5,6,7,8,9,10.
Técnicas alternativas para expressar genes exógenos em um pequeno número de neurônios ópticos foram desenvolvidas em outras espécies-modelo, bem como em X. laevis. No entanto, cada uma dessas abordagens apresenta desafios e limitações quando comparada à microinjeção de DNA/reagente de lipofection em olhos de embriões Xenopus . Em camundongos, a transgênese pode ser usada para expressar genes em um pequeno número de neurônios ópticos, mas a geração de camundongos transgênicos é dispendiosa e os camundongos transgênicos e demorados frequentemente apresentam efeitos colaterais indesejáveis11. O zebrafish transgenic que expressa genes exógenos em neurônios óticos pode igualmente ser criado injetando plasmídeos em embriões adiantados12da fase da segmentação. No entanto, este processo requer a clonagem de um promotor específico para expressar genes em um padrão de mosaico em neurônios ópticos em larvas de zebrafish12. A frequência de expressão de DNA exógeno em neurônios ópticos em zebrafish transgênico também é um pouco menor (< 30%) comparado aos girinos Xenopus que foram microinjetados com reagente de DNA/Liposomal (30 − 60%)12. No ovo o electroporation tem sido usado igualmente para expressar genes no pequeno número de neurônios óticos nos pintainhos13. Entretanto, este procedimento não caracterizou inteiramente os mecanismos que estabelecem projeções óticas porque o arborização ótico do AXON não pode ser imaged em embriões intactos, vivos do pintainho. Finalmente, vários laboratórios usaram eletroporação para transfecção genes em pequeno número de neurônios ópticos em Xenopus girinos14,15. Ainda, o electroporation exige a optimização dos equipamentos e dos protocolos (stimulator, elétrodos, padrões espaciais e temporais de pulsos da onda) Além daquele usado para o microinjection do reagente do ADN/lipofection em ocular de embriões de Xenopus .
Nós e outros usamos previamente a técnica da microinjeção/lipofection do ADN em eyebuds de embriões do Xenopus para determinar os mecanismos autônomos da sinalização da pilha que estabelecem o arborização ótico5,6 do AXON 7 anos de , 8. inicialmenteutilizamos esta abordagem para dissecar as funções da proteína do adaptador de caderina e WNT β-catenina na arborização axonal óptica em Xenopus girinos5,6. Em um estudo, nós mostramos que a ligação β-catenina à α-catenina e ao PDZ é necessária, respectivamente, para iniciar e moldar os mandris axonais ópticos in vivo5. Em um segundo relato, demonstramos que os domínios de ligação β-catenina para α-catenina e GSK-3β modulam de forma oposta os padrões de projeção dos mandris axonais ópticos ventrais6. Mais recentemente, identificamos papéis para o fator WNT, polipose adenomatosa coli (APC), na regulação das características morfológicas de mandris axonais ópticos em Xenopus girinos7. Ao coexpressar o N-terminal e os domínios centrais da APC que modulam a estabilidade da β-catenina e a organização dos microtúnios em conjunto com a GFP em neurônios ópticos individuais, determinamos papéis compartilhados e distintos para esses domínios de interação APC no número de filiais, comprimento e ângulo em mandris axonais ópticos in vivo7. Outro laboratório utilizou a técnica de microinjeção/lipofecção para determinar papéis autônomos de células para sinalização pelo receptor BDNF, TrkB, em mandris axonais ópticos em Xenopus girinos8. Este grupo mostrou que a expressão de um TrkB dominante-negativo perturbou a ramificação e a maturação sináptica em mandris óticos individuais do AXON in vivo8. Globalmente, a técnica de lipofecção no Xenopus já iluminou os papéis específicos de diferentes genes na ramificação do axão óptico no ambiente nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, Nós demonstramos como expressar construções exógenas do ADN no único ou em números pequenos de neurônios óticos e como a imagem GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada em girinos intactos, vivos da râ X . a laevis. Também explicamos como reconstruir e quantificar a morfologia da GFP expressando mandris axonais ópticos a partir de imagens capturadas in vivo. Para expressar os plasmídios exógenos do ADN no número pequeno de neurô…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao touro University California College da Medicina Osteopática por apoiar a nossa pesquisa. Reconhecemos os alunos anteriores no laboratório (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) que ajudaram a implementar esta técnica de microinjeção em nosso laboratório. Estamos gratos ao Dr. Christine Holt, em cujo laboratório esta microinjeção de DNA/técnica de lipofection em embriões Xenopus foi desenvolvida pela primeira vez.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
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