Xenopus laevis भ्रूण में Eyebuds में डीएनए का माइक्रोइंजेक्शन और GFP के इमेजिंग ऑप्टिक Axonal Arbors में बरकरार, रहने वाले Xenopus Tadpoles
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना है कि एक दिन पुराने Xenopus लेविस भ्रूणों की आंखों में डीएनए/DOTAP मिश्रण को माइक्रोइंजेक्ट कैसे किया जाए, और कैसे व्यक्तिगत ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोडॉर्स को टेक्सटल मिडब्रेन में व्यक्त किया जाए और कैसे बनाएं। बरकरार, जीवित Xenopus tadpoles.
Abstract
जलीय मेंढक Xenopus laevis के टैडपोल के प्राथमिक दृश्य प्रक्षेपण तंत्र है कि न्यूरॉन कनेक्टिविटी के विकास को विनियमित अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है. रेटिनो-टेक्टल प्रक्षेपण की स्थापना के दौरान, ऑप्टिक एक्सॉन आंखों से विस्तार करते हैं और अपने लक्ष्य ऊतक, ऑप्टिक टेकटम तक पहुंचने के लिए मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों के माध्यम से नेविगेट करते हैं। एक बार ऑप्टिक एक्सॉन tectum में प्रवेश, वे टर्मिनल arbors कि कार्य synaptic कनेक्शन वे tectum में लक्ष्य interneurons के साथ कर सकते हैं की संख्या में वृद्धि करने के लिए विस्तृत. यहाँ, हम डीएनए एन्कोडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने के लिए एक विधि का वर्णन, और लाभ- और हानि के समारोह जीन constructs, ऑप्टिक न्यूरॉन्स में (रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं) Xenopus भ्रूण में. हम बताते हैं कि एक दिन पुराने भ्रूणों की आंखों में संयुक्त डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक को माइक्रोइंजेक्ट कैसे करें ताकि बाह्य जीन ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एकल या छोटी संख्या में व्यक्त किए जा सकें। GFP के साथ जीन टैगिंग या सह एक GFP प्लाज्मिड के साथ इंजेक्शन द्वारा, बदल आणविक संकेतन के साथ व्यक्तिगत ऑप्टिक न्यूरॉन्स के टर्मिनल axonal arbors बरकरार के दिमाग में सीधे छवि बनाई जा सकती है, Xenopus tadpoles रहने वाले कई दिन बाद, और उनकी आकृति विज्ञान मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल सेल स्वायत्त आणविक तंत्र है कि विवो में ऑप्टिक एक्सॉन arborization के विकास underlie के निर्धारण के लिए अनुमति देता है.
Introduction
तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान, presynaptic न्यूरॉन्स के axons मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों के माध्यम से नेविगेट करने के लिए अपने लक्ष्य क्षेत्रों तक पहुँचने. जब axons अपने लक्ष्य ऊतकों पर आक्रमण, वे postsynaptic लक्ष्य न्यूरॉन्स के साथ synaptic कनेक्शन स्थापित. कई प्रकार के न्यूरॉन्स में, एक्सॉन ्स्समें से वे टर्मिनल शाखाओं या आर्बोर्स 1 के विस्तार नेटवर्क द्वारा कर सकते हैं कि synaptic कनेक्शन की संख्या और स्थानिक सीमा में वृद्धि होतीहै। जलीय मेंढक Xenopus laevis के टैडपोल के रेटिनो-टेक्टल प्रक्षेपण टर्मिनल एक्सॉन आर्बोराइजेशन और synaptic कनेक्टिविटी2,3,4 अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली कशेरुकी मॉडल है . व्यक्तिगत GFP सामान्य और बदल आणविक संकेत के साथ ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त बरकरार में सीधे देखा जा सकता है, रहने वाले Xenopus tadpoles5,6,7,8. अकेले या एक साथ ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में जीन की पूर्ण लंबाई या छोटा संस्करणों के साथ GFP व्यक्त करने के लिए, हम एक दिन पुराने Xenopus भ्रूण9की eyebuds में माइक्रोइंजेक्शन / 10.यह तकनीक मूल रूप से युवा Xenopus टैडपोल्स में ऑप्टिक एक्सॉन पथ खोज के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, और तब से हमारे और दूसरों के द्वारा लागू किया गया है सेल-स्वायत्त आणविक तंत्र ऑप्टिक एक्सॉन अंतर्निहित निर्धारित करने के लिए एक्सिनोपस टैडपोल्स5,6,7,8,9,10में वृक्षीकरण .
ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में exogenous जीन व्यक्त करने के लिए वैकल्पिक तकनीक अन्य मॉडल प्रजातियों में विकसित किया गया है, साथ ही एक्स laevisमें. तथापि, इनमें से प्रत्येक दृष्टिकोण एक्सनोपस भ्रूणों की आंखों में डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक के माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में चुनौतियां और सीमाएँ प्रस्तुत करता है। चूहों में, ट्रांसजेनेसिस का उपयोग ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में जीनों को व्यक्त करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी महंगा है और समय लेने वाली और ट्रांसजेनिक चूहों अक्सर अवांछनीय दुष्प्रभावों के साथ मौजूद11. ऑप्टिक न्यूरॉन्स में बहिर्जात जीनों को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक जेब्राफ़िश को प्रारंभिक क्लीवेज अवस्थाभ्रूणों मेंप्लाज्मिड इंजेक्शन लगाकर भी बनाया जा सकता है . हालांकि, इस प्रक्रिया के लिए एक विशिष्ट प्रमोटर की क्लोनिंग की आवश्यकता होती है जो जेब्राफिश लार्वा 12 में ऑप्टिक न्यूरॉन्स में मोज़ेक पैटर्न में जीनों को व्यक्त करताहै। ट्रांसजेनिक जेब्राफ़िश में ऑप्टिक न्यूरॉन्स में exogenous डीएनए की अभिव्यक्ति की आवृत्ति भी कुछ कम है ([lt;30%) Xenopus tadpoles की तुलना में है कि डीएनए के साथ microined थे/ ओवो इलेक्ट्रोपोट्रेशन में भी13चूजों में ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में जीनों को व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया गया है . हालांकि, इस प्रक्रिया को पूरी तरह से तंत्र है कि ऑप्टिक अनुमानों की स्थापना की विशेषता में विफल रहा है क्योंकि ऑप्टिक एक्सॉन arborization बरकरार, रहने वाले लड़की भ्रूण में छवि नहीं किया जा सकता है. अंत में, कई प्रयोगशालाओं ने जीनों को ट्रांसफेक्ट करने के लिए इलेक्ट्रोपोट्रेशन का उपयोग किया है जो कि एक्सिनोपस टैडपोल्स14,15में ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में होता है । फिर भी, इलेक्ट्रोपोरोनेशन के लिए उपकरणों और प्रोटोकॉलों (तरंग दालों के स्टिम्युलेटर, इलेक्ट्रोड, स्थानिक और अस्थायी पैटर्न) के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जिसका उपयोग Xenopus भ्रूणों की आंखों में डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक के माइक्रोइंजेक्शन के लिए किया जाता है।
हम और अन्य लोगों ने पहले एक्सनोपस भ्रूणों की आंखों में सूक्ष्म इंजेक्शन/लिपोफेक्शन की तकनीक का उपयोग सेल स्वायत्त संकेतन तंत्र का निर्धारण करने के लिए किया जो ऑप्टिक एक्सॉन आर्बोाइजेशन5,6, 7 , 8.हमने शुरू में इस दृष्टिकोण का उपयोग जेनोपस टैडपोल्स5,6में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोाइजेशन में कैदरिन और वंट एडेप्टर प्रोटीन के कार्यों को विभाजित करने के लिए किया था. एक अध्ययन में हमने यह दिखाया कि विवो5में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोजरों को आरंभ करने और उसे आकार देने के लिए क्रमशः जेड-कैटेनिन और पीडीजेड के लिए जेड-कैटेनिन के लिए बाध्यकारी होने की आवश्यकता है। दूसरी रिपोर्ट में हमने यह प्रदर्शित किया कि $-कैटिनिन तथा जीएसके-3 के लिए जेड-कैटिनन बाध्यकारी डोमेन, अधर ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स6के विपरीत रूप से मॉडुलेट प्रक्षेप पैटर्न। हाल ही में, हमने Xenopus tadpoles7में ऑप्टिक ऐक्सोनल आर्बोर्स की आकृतिक विशेषताओं को विनियमित करने में Wnt कारक, एडेनोमैटस पोलिपोसिस कोलाई (एपीसी) के लिए भूमिकाओं की पहचान की। APC के N-terminal और केंद्रीय डोमेन को सह-व्यक्त करके जो अलग-अलग ऑप्टिक न्यूरॉन्स में GFP के साथ-साथ जेड-कैटेनिन स्थिरता और माइक्रोट्युबल संगठन को मॉडुलित करते हैं, हमने शाखा संख्या पर इन एपीसी इंटरैक्शन डोमेन के लिए साझा और अलग-अलग भूमिकाएं निर्धारित की हैं, लंबाई, और विवो7में ऑप्टिक axonal arbors में कोण . एक अन्य प्रयोगशाला ने एक्सनपोस टैडपोल्स8में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स में बीडीएनएफ रिसेप्टर, टी.के.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी. रिसेप्टर द्वारा संकेतन के लिए सेल स्वायत्त भूमिकाओं का निर्धारण करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन/लिपोफेक्शन तकनीक का उपयोग किया। इस समूह ने यह दिखाया कि विवो8में व्यक्तिगत ऑप्टिक एक्सॉन आर्बोमेंस में एक प्रमुख-नकारात्मक TrkB क्षुब्ध शाखाकरण और synaptic परिपक्वता की अभिव्यक्ति. कुल मिलाकर, Xenopus में lipofection तकनीक पहले से ही देशी वातावरण में ऑप्टिक एक्सॉन शाखाओं में विभिन्न जीन की विशिष्ट भूमिकाओं को प्रकाशित किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में, हम प्रदर्शित कैसे exogenous डीएनए ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एकल या छोटी संख्या में constructs व्यक्त करने के लिए और कैसे छवि के लिए व्यक्तिगत GFP ऑप्टिक axonal arbors बरकरार में सामान्य और बदल आणविक संकेतन के साथ व्यक्त …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने अनुसंधान का समर्थन करने के लिए Touro विश्वविद्यालय कैलिफोर्निया कॉलेज Osteopathic चिकित्सा के लिए धन्यवाद. हम प्रयोगशाला में पिछले छात्रों को स्वीकार करते हैं (एस्तेर वू, ग्रेगरी पेंग, Taegun जिन, जॉन लिम) जो हमारी प्रयोगशाला में इस microinctions तकनीक को लागू करने में मदद की. हम डॉ क्रिस्टीन होल्ट के आभारी हैं, जिनकी प्रयोगशाला में Xenopus भ्रूण में इस डीएनए microinction /
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
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