Summary
Den akutte leversvigt dyremodel udviklet i den nuværende undersøgelse præsenterer et realistisk alternativ til studiet af potentielle terapier. Den nuværende model anvender den kombinerede virkning af fysisk og lægemiddelinduceret leverskade og giver et passende tidsvindue til at undersøge potentialet i nye terapier.
Abstract
Akut leversvigt (ALF) er en klinisk tilstand forårsaget af forskellige ætiologier resulterer i tab af metaboliske, biokemiske, syntetisere, og afgiftende funktioner i leveren. I de fleste irreversible leverskader tilfælde, ortotropisk levertransplantation (OLT) er fortsat den eneste tilgængelige behandling. For at studere den terapeutiske potentiale af en behandling for ALF, dens forudgående testning i en animalsk model af ALF er afgørende. I den nuværende undersøgelse, en ALF model i rotter blev udviklet ved at kombinere 70% partiel hepatektomi (PHx) og injektioner af acetaminophen (APAP), der giver en terapeutisk vindue af 48 h. De mediane og venstre laterale lapper af leveren blev fjernet til punkt 70% af lever massen og APAP blev givet 24 timer postsurgically i 2 dage. Overlevelse i ALF-induceret dyr blev konstateret at være alvorligt nedsat. Udviklingen af ALF blev bekræftet af ændrede serumniveauer af enzymerne alaninaminotransferase (ALAT), aspartat-aminotransferase (AST), alkalisk fosfatase (ALP); ændringer i protrombintid (PT); og vurdering af den internationale normaliserede ratio (INR). Studiet af genekspressions profilen ved qPCR afslørede en stigning i ekspressions niveauerne for gener, der er involveret i apoptose, inflammation og i progression af leverskade. Diffvant degeneration af hepatocytter og infiltration af immunceller blev observeret ved histologisk evaluering. ALFS reversibilitet blev bekræftet ved genoprettelse af overlevelse og serumniveauer af ALAT, AST og ALP efter intrasplenisk transplantation af syngeneiske raske rotte hepatocytter. Denne model præsenterer et pålideligt alternativ til de tilgængelige ALF dyremodeller for at studere ALFS Patofysiologi og evaluere potentialet i en ny terapi for ALF. Brugen af to forskellige tilgange gør det også muligt at studere den kombinerede virkning af fysisk og lægemiddelinduceret leverskade. Den nuværende procedures reproducerbarhed og gennemførlighed er en ekstra fordel ved modellen.
Introduction
Akut leversvigt (ALF) er defineret af den amerikanske forening for studiet af leversygdomme som hurtig udvikling af akut leverskade uden nogen forudgående tegn på skader og er karakteriseret ved svær svækkelse af de syntetiske, metaboliske, og afgiftende funktioner i leveren1. Alf adskiller sig fra kronisk leversvigt, hvor fejlen opstår som følge af leverskade forårsaget over en lang periode og fra akut kronisk leversvigt (aclf), hvor pludselige leverskader finder sted som følge af kroniske leversygdomme2,3,4. Den eneste tilgængelige kur for alf er ortotopisk levertransplantation (OLT), eller døden kan forekomme. På grund af manglen på lever donorer er dødeligheden hos patienter, der lider af ALF, meget høj.
At studere potentialet i alternative terapeutiske tilgange og for bedre at forstå Patofysiologi af ALF, dyremodeller, der kan afspejle ALF forekommer i mennesker er nødvendige. Mange af de allerede tilgængelige ALF dyremodeller har flere mangler. Acetaminophen (APAP) effekter er vanskelige at reproducere, men har de tætteste ligheder i form af tidsmæssige, kliniske, biokemiske, og patologiske parametre. APAP-induceret dyremodeller ofte støder på problemer på grund af tilstedeværelsen af methæmoglobinæmi forårsaget af oxidation af hæmoglobin af APAP og dets mellemprodukter5,6,7. Et andet problem er den manglende reproducerbarhed afspejles af uforudsigelige dosis svar og dødstidspunktet. Alf animalsk modeller fremstillet ved hjælp af Carbon Tetra chlorid (CCL4) har dårlig reproducerbarhed8,9,10,11. Concavalin A (CON a) og lipoplysaccharid (LPS)-inducerede alf dyremodeller afspejler ikke det kliniske mønster af den menneskelige sygdom, selv om de har fordele i studiet af cellulære mekanismer involveret i autoimmune leversygdomme og i studiet af sepsis henholdsvis12,13,14,15. Tilsvarende, thioacetamid (TAA) kræver også biotransformation til en aktiv metabolit thioacetamid sulfoxid og viser art variation16,17,18,19. D-galactosamin (d-gal) producerer nogle biokemiske, metaboliske, og fysiologiske ændringer svarende til alf, men er ikke i stand til at afspejle hele alf patologiske tilstand20,21,22,23. Der har været meget få forsøg på at kombinere to eller flere af disse metoder til at udvikle en ALF model, der er i stand til at afspejle ALF syndrom på en bedre måde13. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser for at udvikle en model, der kan afspejle sygdoms parametrene, har bedre reproducerbarhed og giver tilstrækkelig tid til at studere virkningerne af en terapeutisk intervention.
I den nuværende undersøgelse, en alternativ ALF model i rotter er blevet skabt ved at kombinere virkningerne af partiel hepatektomi (PHx) og lavere doser af en hepatotoksisk reagens. APAP har en veletableret rolle i at forårsage leverskade5,24,25. Det er en almindeligt anvendt analgetikum og er giftigt for leveren ved supraterapeutiske doser ved at danne giftige metabolitter. APAP er årsag til mange dødsfald i de udviklede lande. Fysisk skade forårsaget af delvis hepatektomi indleder aktivering af forskellige processer, der er involveret i inflammation samt lever regenerering. Injektion af hepatotoksiske agent APAP forårsager et fjendtligt miljø i leveren, forhindre spredning af hepatocytter. Dette reducerer stressperiode på dyret, som, når det kombineres med mindre doser af hepatotoksiner, fører til bedre reproducerbarhed af proceduren. Derfor, ved hjælp af denne model, en kombinatorisk effekt af to typer af leverskader er blevet undersøgt. At karakterisere den udviklede ALF dyremodel, fysiologiske og biokemiske parametre er blevet undersøgt. Vellykket reversibilitet af ALF blev bekræftet ved transplantation af syngeneiske raske rotte hepatocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den procedure, der er beskrevet nedenfor, er blevet godkendt af det institutionelle dyreetiske udvalg under National Institute of Immunology, New Delhi. Det serielle referencenummer for godkendelsen er IAEC # 355/14.
1. forberedelse
- Forbered dig på den kirurgiske procedure som beskrevet tidligere af DAS B et al.26.
- Brug 6 – 8-ugers gamle indavlede Wistar rotter med en kropsvægt på 200 – 250 g.
- Hus dyrene under standard dyrenes pleje betingelser og fodre dem med rotte Chow og libitum før og efter proceduren.
- Ved udførelse 70% PHX, brug en standard cocktail blanding af ketamin hydrochlorid (100 mg/kg legemsvægt) og xylazin (10 mg/kg legemsvægt), som injiceres intraperitoneally.
Bemærk: den anvendte type bedøvelsesmiddel kan have postoperative virkninger på dødelighed og sygelighed. - Under celletransplantation anvendes inhalations anæstesi isofluran (2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1, 1, 1-trifluoro-Ethan) for at reducere tidspunktet for genvinding af dyret efter transplantations operationen.
- Inducere og vedligeholde inhalationel bedøvelse ved hjælp af en tilpasset anæstesi system. Opretholde ilttilførslen ved 4 L/min. Til induktions brug isofluran ved 4% og til vedligeholdelses brug 2 – 3% under den kirurgiske procedure.
2. Præoperative procedurer
- Bedøve rotten ved at injicere ketamin-xylazine blandingen beskrevet i trin 3,1 intraperitoneally. Bekræft den komplette bedøvelsesmiddel ved at klemme dyrets tå. Yderligere procedurer udføres kun, når der ikke er nogen pedal refleks.
- For at forhindre hornhinde tørring, anvende en carboxy methyl-cellulosebaseret øjendråbe til begge øjne.
- Begrænse det bedøvede dyr til et kirurgisk bord ved hjælp af hvidt tape. Placer dyret med abdominalsiden opad, så munden er på den distale side fra den person, der udfører operationen.
- Fjern håret fra øverste højre abdominale kirurgiske område ved hjælp af en elektrisk Clipper.
- Desinficer operationsstedet med tre vekslende scrubs af povidon jod og 70% ethanol ved hjælp af steriliserede bomulds puder i cirkulær bevægelse.
3. partiel hepatektomi (PHx) for at fjerne 70% af massen af leveren
Bemærk: Udfør hele den kirurgiske procedure under et sterilt miljø i en laminar flow hætte. Brug kun sterile kirurgiske instrumenter for at minimere risikoen for infektion postsurgically. Fjernelse af 70% af lever massen, med navnet 70% partiel hepatektomi (70% PHx), blev udført som beskrevet af C. Mitchell og H. Willenbring, 200827.
- Før starten af operationen, bekræfte den komplette bedøvelsesmiddel af dyret ved at klemme sin tå. Yderligere procedurer udføres kun, når der ikke er nogen pedal refleks.
- Marker huden, der skal skæres lige under brystbenet, vinkelret på xiphoid, og parallelt med ribburet.
- Anbring et sterilt drapere-ark med en åbning på ca. 3 cm x 1 cm over den mærkede hud.
- Udfør en tværgående indsnit på omkring 2 – 3 cm langs den markerede linje med en skalpel. Brug kirurgisk klinge nr. 22. Fjern forsigtigt hudens fastgørelse til det underliggende muskellag i nærheden af det indsnitede område ved hjælp af sterile fugtet bomulds spidser.
- Dernæst lave en tværgående snit gennem peritonealdialyse lag lige under xiphoid proces.
- Ved hjælp af to saltvand fugtet bomuld tips, udsætte venstre lap af leveren ved at anvende forsigtigt pres på brystkassen. Placer en bomulds spids på det diafragmatiske område af den indsnit lige del og den anden bomulds spids under den indsnit lige region for at løfte leveren lobe op.
- Slip en 8 – 10 cm lang steril nylon gevind løkke (størrelse 4 – 0, 0,15 mm diameter) omkring den udsatte leverlobe. Tag Løkken til bunden af lobe tæt på hilum ved hjælp af microdissecting tang eller fugtet bomulds knopper.
- Ved hjælp af mikrokirurgi nåleholderen og mikropincet, binde de to ender af løkken, placere knude så tæt på bunden af lobe som muligt at snøre blodkar og reducere blødning efterlever lap fjernes. Binde to ekstra knuder på den anden side.
- Tag forholdsregler for ikke at binde knuden for tæt på de nærliggende blodkar, som ellers kan forårsage venøs obstruktion (stenose).
- Brug mikrokirurgi saks til at skære den bundne lap lige over knuden, som efterlader en misfarvet masse af væv kaldet en iskæmisk stump i stedet for lap.
Bemærk: rotte leveren, ligesom dem af mus, er opdelt i fire særskilte lapper: median lap, højre lateral lap, venstre lateral lap, og hale lap, som repræsenterer omkring 40%, 20%, 30%, og 7% af den samlede lever masse, hhv. Enhver kombination af disse lapper kan fjernes til punkt 70% lever masse. I den aktuelle undersøgelse blev median lobe og venstre laterale lapper fjernet. - Find forsigtigt den mediane lap uden at beskadige den resterende stump af venstre lateral lap. Forsigtigt trække det ud af bughulen, og ved foden af lobe binde en 8 – 10 cm lang nylon tråd (størrelse 4 – 0) knude som tidligere nævnt. Binde to ekstra knuder på den anden side. Forsigtigt punkt og fjerne den bundne median lap tage alle de nævnte forholdsregler.
- Efter fjernelse af lapper, suturere bughinde ved hjælp af en absorberbare krom 4 – 0 sutur med kontinuerlige masker efterfulgt af huden suturering med en afbrudt sutur.
- Påfør povidon jod på huden omkring suturer for at forhindre infektion.
- Fjern drapere arket og fjern dyret fra Operations brættet.
4. postoperativ pleje hos dyr
- Intraperitonealt injicerer dyret med en dosis på 12 mg cefotaxim antibiotikum i 1 ml 5% glucoseopløsning med en 1 ml sprøjte for at beskytte den mod risikoen for postoperativ infektion.
- Giv en subkutan injektion af analgetisk meloxicam (1 mg/kg legemsvægt) til smertelindring efter operationen, og følg den op med yderligere to doser, der holder regimet som én dosis pr. dag.
- Hus de opererede dyr under standardbetingelser på 12 h lys/mørk cyklus og overvågning med jævne mellemrum.
5. injektion af lægemiddel i delvist hepatectomized dyr for at inducere leversvigt
- Efter 24 timers post operation, når dyrene med succes har genvundet fra 70% PHx, mål kropsvægten af dyret efterfulgt af injektionerne.
- Injicer 750 mg/kg legemsvægt af APAP intraperitonealt i delvist hepatectomized dyr 24 timer efter den 70% PHx som følge af dyrenes vellykkede helbredelse fra kirurgisk indgreb. Gentag dosis efter 24 timer.
Bemærk: to doser APAP administreres intraperitonealt til dyret (dvs. 24 timer og 48 h efter henholdsvis 70% PHx-proceduren). - På hvert tidspunkt efter injektion af APAP, måle kropsvægten af inddrive dyret.
Bemærk: APAP (biocetamol) injiceres i dyr som en 150 mg/mL opløsning i 2% benzylalkohol.
6. transplantation af sunde hepatocytter i ALF dyremodeller
Bemærk: for at studere ALFS reversibilitet hos rotter, transplantation raske syngeneiske rotte hepatocytter intrasplenisk i ALF-induceret dyr sammen med den 1St dosis af APAP. I den nuværende undersøgelse, at give rigelig tid til de transplanterede celler til homing og engraftment, transplantation blev udført lige efter at give den 1St dosis af APAP. Rotte hepatocytter er isoleret ved en protokol først offentliggjort af Berry og Friends et al.28 og senere tilpasset i forskellige andreundersøgelser 29,30,31 med nogle modifikationer. For intrasplenisk transplantation af celler i ALF-dyremodellen skal du følge nedenstående trin.
- Placer rotten i et poly (methylmethacrylat) kammer til induktion af anæstesi med 4% isofluran og 4 L/min oxygen flow for en rotte på 250 – 350 g legemsvægt. Check for dybden af anæstesi ved manglen på pedal reflekser, når klemning tåen af dyret.
- Anbring den bedøvelses rotte på Operations brættet således, at den venstre laterale del vender opad. Oprethold anæstesi ved 2 – 3% isofluran indånding gennem et passende mundstykke.
- Barberer huden på den venstre laterale region og sterilisere det ved povidon jod opløsning.
- Lav en tværgående indsnit på den barberede region af huden.
- Lav en 1 – 2 cm skåret i peritonealdialyse lag for at afsløre milten.
- Tag forsigtigt milten af bughulen ud og løft den op ved hjælp af to fugtet bomulds spidser.
- Hold cellerne (typisk 107 pr. dyr), der skal transplanteres, suspenderet i 50 ΜL imdm-medier i en 1 ml insulin sprøjte med en 29 G nål.
- Perforér forsigtigt nålen ind i milten cortex og slip cellesuspensionen i milten inden for 2 – 3 minutter.
- Efter celletransplantation er afsluttet, forsigtigt tage nålen ud og dup området af nålen punktering med en fugtet bomuld spids for at undgå lækage af cellen suspension fra stedet.
- Luk bughinden og huden med en 4 – 0 absorberbare sutur med henholdsvis kontinuerlig og diskontinuerlig suturering.
- Påfør povidon jod opløsning på huden på stedet af suturer for at forhindre infektion på det opererede websted.
- Intraperitonealt injicerer 1 mL volumen på 12 mg/mL antibiotikum (f. eks. cefotaxime) og injicerer subkutant analgetikum (f. eks. meloxicam) 1 mg/kg legemsvægt til dyret som en del af postoperativ pleje. Flyt dyret til en varm inddrive bur.
- Hold det opererede dyr isoleret under normale forhold på 12 timer lys/mørk cyklus, indtil de kirurgiske sår er fuldstændig helet. Dette kan tage 3 – 4 dage.
7. Karakteristik af ALF udvikling
- Euthanize dyrene ved overdosering af ketamin-xylazine opløsning 2 h efter den 2nd dosis af APAP behandling og indsamle blod og vævsprøver.
- Saml serum fra blod for biokemiske undersøgelser32.
- Behandl prøver af levervæv til histologiske og genekspressions undersøgelser33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelsesprocenten i animalske modeller af ALF
Den optimale dosis APAP til at forårsage ALF i kombination med 70% PHx blev standardiseret som 750 mg/kg legemsvægt. Behandlingsregimet startede 24 timer efter 70% PHx, da dyrene var helt genvundet fra operationen, og bestod af to APAP doser med 24 timers intervaller. Dødelighed blev observeret med en hastighed på 80% efter administration af den anden dosis APAP, 48 h post-kirurgi. Overlevelsesprocenten blev analyseret og plottet via Kaplan-Meier-metoden (figur 1). Den reproducerbarhed i tidspunktet for død og tidsperiode, som denne model gør det en egnet kandidat til at studere en terapeutisk intervention mod ALF.
Der blev taget hensyn til fire grupper af dyr i undersøgelsen: gruppe 1 (kontrolgruppe, kun salt behandling), gruppe 2 (kun APAP ved 750 mg/kg legemsvægt), gruppe 3 (saltvands behandling med 70% PHx) og gruppe 4 (APAP ved 750 mg/kg legemsvægt med 70% PHx). Tre dyr hver blev inkluderet i alle grupper og to repræsentative billeder er inkluderet fra hver gruppe. Dyr fra alle fire grupper blev aflives 2 timer efter administration af den 2nd dosis af den pågældende behandling. Leverprøver taget fra alle fire grupper viste distinkte morfologi fra hinanden. Gruppe 1 viste den rødbrune morfologi af en sund gnaver lever. Leverprøver af gruppe 2 viste ingen synlige tegn på skade på et morfologisk niveau og viste samme udseende som raske lever i gruppe 1. Leverprøver taget fra gruppe 3 og 4 viste ikke raske og havde misfarvning og en ujævn udseende. Misfarvningen svarer til skaden i levervævet og var mere tydelig i gruppe 4. Repræsentative data præsenteres i figur 2.
Omfanget af leverskade blev bestemt ved at kontrollere serumniveauerne af ALAT-, AST-og Alp-enzymer36,37,38. Niveauerne af ALAT, AST og ALP viste markante forskelle mellem de fire grupper, der svarer til omfanget af leverskader. Gruppe 4 viste en signifikant stigning i asat-og ALP-niveauerne sammenlignet med gruppe 1 (figur 3).
For at sammenligne genekspressions profilen i kontrol-og alf-inducerede grupper blev der udført q-PCR-analyse af gener involveret i celledød (Bax2, Caspase3, FAS) i lever vævsprøver35,39. Disse blev anset for at være upregulerede i gruppe 3 sammenlignet med kontrolgruppe 1, hvorimod der ikke sås nogen forskel i gruppe 2 og gruppe 4. Gener, som vides at være overudtrykt som reaktion på leverskade (Mcp1 og Mmp2)33,40 fandtes at være upregulated i alle tre grupper i forhold til kontrolgruppe 1. Mmp9 blev upreguleret i gruppe 3 og 4, hvorimod gruppen 2 ikke viste nogen markant forskel fra kontrolgruppe 1. Ekspressions niveauerne for Timp1 og Timp234 fandtes at være højere i gruppe 3, men viste ingen markant over ekspression i gruppe 4 (figur 4).
Gener, der er involveret i leverbetændelse (tnfa, IL1a, Tgfbr1 og IL1b)41,42,43,44 fandtes at være overudtrykt i gruppe 3 sammenlignet med kontrolgruppe 1, men deres ekspressionsniveau faldt i gruppe 4. ALR er overudtrykt i levervæv efter induktion af leverskade. Downstream kaskader af dette gen hjælpe i leveren regenerering. RIP1 protein er nødvendigt i APAP-induceret toksicitet. Det konstateredes, at ALR og RIP1 var upregulerede i gruppe 2 og 3 sammenlignet med kontrolgruppe 1, hvorimod deres niveauer fortsat svarer til eller er lavere i gruppen 4. Alpha glat muskel actin (aSMA), en markør for overdreven ECM deposition, der yderligere fører til fibrose, fandtes at være upregulated i gruppe 3 og 4 i forhold til kontrolgruppe 1 (figur 4). Genekspression data tyder på, at de ovennævnte biomarkører af betændelse og celledød, der vides at være overudtrykt under leverskade er upregulated i leveren vævsprøver af dyr, hvor ALF var-induceret af foreslåede metode, hvilket bekræfter forekomsten af leverskade på molekyleniveau.
Hematoxylin og eosin (H & E) farvning
Hematoxylin og eosin (H & E) farvning blev gjort for at vurdere sværhedsgraden af leverskade ved at observere omfanget af hepatocyt degeneration. De sektioner af levervævet, der blev farvet med H & E, blev underkastet en blind analyse af en tredjepart. I 70% partiel hepatektomi gruppe vesikulær fedtdegeneration blev observeret og i acetaminophen gruppe Portal inflammation og nekrose blev set sammen med mild sinusformet dilatation. Vesikulær fedtdegeneration blev observeret for det meste i ALF-gruppen (figur 5).
Protrombintid og blodsukkerniveau
Protrombintid (PT) er en parameter, der afhænger af aktiviteten af leveren-syntetiseret væv tromboplastin og bruges til at karakterisere effektiviteten af blod koagulations mekanismen45. Generelt observeres en stigning i PT i betingelserne for leverrelaterede sygdomme. PT viste sig at være signifikant højere i den ALF-inducerede gruppe i forhold til kontrolgruppen. Den internationale normaliserede ratio (INR)45 blev også fundet at være højere, hvilket repræsenterer en defekt i mekanismen for blod koagulation som følge af ineffektiv lever fysiologi (figur 6).
Evaluering af overlevelse efter celle sund syngeneisk rotte hepatocytter transplantation
Et vigtigt kriterium for en ALF-model er reversibilitet af leversvigt i tilstedeværelse af en terapeutisk intervention. I den nuværende undersøgelse, 10.000.000 raske syngeneiske rotte hepatocytter blev transplanteret instrasplenically at observere effekten af celletransplantation terapi på leversvigt. Det korrekte antal celler, der skal transplanteres, blev bestemt ved at observere reversibiliteten af leversvigt efter transplantation af forskellige cellenumre (data ikke vist). Cellerne blev transplanteret efter indgivelse af den 1-St dosis APAP, og overlevelse blev fundet at være genoprettet i dyr efter transplantation af celler (figur 7). Serumniveauerne af enzymer ALAT, AST og ALP blev fundet normaliseret efter 10 dages celletransplantation (figur 8).
Figur 1: overlevelsesprocenten i den alf-inducerede gruppe. Kaplan-Meier overlevelses kurve, der viser overlevelsesprocenten af dyr efter induktion af ALF med kombinationen af 70% PHx og APAP-dosis (750 mg/kg legemsvægt). Tid 0 h angiver klokkeslættet på 70% PHx. De 1St og 2nd doser APAP blev administreret 24 og 48 h postkirurgisk (n = 12, samlede dyr). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative billeder af lever morfologi i de fire forskellige grupper, der indgår i studiet. Billedpaneler A – D viser morfologien af lever af forskellige grupper efter at være blevet aflives 2 h efter den 2nd dosis af den pågældende behandling. A) lever morfologien i kontrolgruppe 1, hvor der kun blev givet saltvand. B) lever morfologien i gruppe 2, hvor kun APAP blev givet ved en dosis på 750 mg/kg legemsvægt. C) lever morfologien i gruppe 3, hvor der blev givet saltvand efter 70% PHX.D) lever morfologien i gruppe 4, hvor apap blev givet efter 70% PHX ved den dosis, der svarer til gruppe 3 (n = 3 dyr pr. gruppe). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: en sammenligning af den biokemiske profil af serum i de forskellige grupper. Søjlediagrammer repræsenterer middelværdien af ALAT, AST og ALP i serumprøver af de fire grupper, der indgår i studiet. Serum blev indsamlet 2 timer efter den 2nd dosis af den pågældende behandling. Fejllinjer = S. E. M; = p < 0,001; * = p < 0,05; n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: profil for genekspression af levervævs prøver. Søjlediagrammer repræsenterer den relative kvantificering af mRNA-ekspression af forskellige gener involveret i inflammation og celledød i de fire grupper, der udsættes for forskellige behandlinger. Alle gener blev normaliseret mod ekspression af kontrol Gapdh. Fejl linje = standardfejl middel for de tre forskellige prøver (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: histologisk undersøgelse af levervævs prøver. Repræsentative hematoxylinlegemer og eosin farvning billeder af leveren vævsprøver fra de fire grupper, der indgår i undersøgelsen, som observeret under 200x forstørrelse i lyse felt mikroskopi. Der var for det meste normale hepatocytter i kontrolgruppe 1 med mild Portal infiltration (grønne pile). I gruppe 3 (70% partiel hepatektomi) blev vesikulær fedtdegeneration observeret (hvide pile) og i acetaminophen gruppe 2 Portal betændelse (røde pile) og nekrose blev set sammen med mild sinusformet dilatation (gule pile). Makrovesikulær fedtdegeneration blev for det meste observeret i ALF gruppe 4 (orange pile). Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: sammenligning af protrombintid (PT) og international normaliseret ratio (INR). (A) sammenligning af PT mellem kontrolgruppe 1 (saltvandsindsprøjtning post 70% PHX) og alf-induceret gruppe 4 (APAP injektion post 70% PHX). Blod blev indsamlet 2 timer efter den 2nd dosis af den respektive behandling og tid (i sekunder) kræves for fibrin koageldannelse er vist på Y-aksen (* * * * = p < 0,0001, n = 5). B) INR i den alf-inducerede gruppe 4 sammenlignet med kontrolgruppe 1. Middelværdien af INR i gruppe 4 blev konstateret at være 2,28, hvilket falder i den warfarin-inducerede antikoagulerende virkning (n = 5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: overlevelsesprocenten i alf-induceret gruppe efter celletransplantation. Kaplan-Meier overlevelses kurve, der viser overlevelsesprocenten efter en sund hepatocyt transplantation i den ALF-inducerede gruppe 4 sammenlignet med kontrolgruppe 1 (n = 5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: serum biokemisk profil af Alf-inducerede dyr efter celletransplantation. Serumniveauer af enzymer ALAT, AST, og Alp 10 dage efter celletransplantation i sammenligning med serumniveauerne af Alf-induceret dyr aflives efter en 2nd dosis af APAP administration. Fejl linje = standardfejl ved gennemsnittet af fem forskellige prøver; = p < 0,0001; * * = p > 0,01; n = 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklingen af en passende dyremodel for ALF er altafgørende for en bedre forståelse af patogenesen og progression af ALF. En velkarakteriseret ALF dyremodel giver også mulighed for udvikling og afprøvning af nye terapeutiske tilgange mod ALF. Der er gjort mange forsøg på at udvikle en klinisk relevant model af Alf6,12,21,23,46,47,48. De fleste af disse undersøgelser enten udnytte kirurgiske procedurer eller inducere leverskade af hepatotoksiske kemikalier.
Det er svært at skabe en ALF model af PHx alene, fordi PHx ikke ville afspejle patologi af ALF på grund af fravær af betændelse forårsaget af nekrotiske og apoptotiske væv. Ved terapeutiske doser metaboliseres APAP fuldstændigt ved glucoronidation og sulbations processerne. Ved højere doser, når disse veje er mættet, APAP metaboliseres af cytochrom P450 enzymer, som primært er syntetiseret af hepatocytter, resulterer i dannelsen af en giftig mellemliggende, NAPQI (N-acetyl-p-Benzoquinon imine). Under normale forhold er napqi neutraliseret af glutathion (GSH) reserver af celler, mens ved supraterapeutiske doser det forårsager oxidativt stress i hepatocytter, resulterer i hepatocyt død4,24,25,46. Derfor, ved at kombinere de fysiologiske virkninger af 70% PHx og APAP-induceret leverskade, en ALF rotte model blev oprettet i den nuværende undersøgelse. En mindre terapeutisk vindue reducerer stressperiode på dyret. Når det kombineres med mindre doser af APAP, dette fører til bedre reproducerbarhed af proceduren.
Dosis af APAP blev valgt til at give et passende terapeutisk vindue, hvor der kan gives en terapeutisk intervention til dyret (dvs. inden for 48 h af den 1St dosis og 24 timer af 2nd dosis). Inden for 24 timer efter den 2nd dosis apap blev 100% dødelighed observeret. Men dødstidspunktet inden for denne periode var variabel for hvert dyr. Derfor, med henblik på at studere udviklingen af Alf, dyrene blev aflives på et standard tidspunkt på 2 h efter 2nd dosis af APAP.
Tidspunktet for terapeutisk intervention kan afgøres afhængigt af den enkelte undersøgelse og den type terapi, der undersøges, som i den nuværende undersøgelse var transplantation af syngeneiske rotte hepatocytter lige efter den 1St dosis af APAP, så cellerne nok tid til hjemmet og forankret. I den nuværende model, transplantation af mindst 10.000.000 celler er nødvendig for en vellykket redning fra ALF.
For at sikre, at den kirurgiske procedure bliver en succes, bør der tages hensyn til et par vigtige punkter. Det anbefales at bruge forskellige typer af anæstetika i forskellige kirurgiske procedurer. For at udføre delvis hepatektomi, en cocktail af ketamin-xylazine bør anvendes i de anbefalede doser, fordi det giver rigelig tid til at fuldføre den kirurgiske procedure. Under celletransplantation bør der anvendes inhalerbar anæstesi isofluran, fordi det reducerer den fysiske belastning af ALF-inducerede dyr.
Som konklusion, på grund af en ensartet dødelighed og en bekvem terapeutisk vindue, en APAP og 70% PHx kombineret model blev anvendt til at studere reversibilitet af ALF ved celletransplantation. For at vurdere ALFS reversibilitet blev 10.000.000 raske syngeneiske rotte hepatocytter transplanteret intrasplenisk i ALF-inducerede dyr. Efter transplantation konstateredes det, at overlevelsesprocenten steg i ALF-inducerede dyr. Forbedring i serumniveauer af ALAT, AST, og ALP blev også observeret hos dyr efter celletransplantation, tyder på genoprettelse af lever metabolisme. Denne ALF dyremodel præsenterer et alternativ til at evaluere det terapeutiske potentiale af celler, som bygger bro mellem akut leversvigt og levertransplantation. Det giver også mulighed for at studere leverskader forårsaget af fysisk skade og hepatotoksiske middel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af kerne tilskuddet modtaget fra Institut for bioteknologi, Indiens regering til National Institute of Immunology, New Delhi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, Suppl 2 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
