Summary
Mevcut çalışmada geliştirilen akut karaciğer yetmezliği hayvan modeli potansiyel tedavilerin incelenmesi için uygun bir alternatif sunuyor. Mevcut model, fiziksel ve ilaca bağlı hepatik yaralanmanın kombine etkisini kullanır ve yeni tedavilerin potansiyelini incelemek için uygun bir zaman penceresi sağlar.
Abstract
Akut karaciğer yetmezliği (ALF), karaciğerin metabolik, biyokimyasal, sentezleme ve detoksifiye fonksiyonlarının kaybına neden olan çeşitli etiyolojilerin neden olduğu klinik bir durumdur. Çoğu geri dönüşümsüz karaciğer hasarı durumlarda, ortotropik karaciğer nakli (OLT) mevcut tek tedavi kalır. ALF için bir tedavinin tedavi potansiyelini incelemek için, ALF bir hayvan modeli nde önceki test esastır. Mevcut çalışmada sıçanlarda ALF modeli %70 parsiyel hepatektomi (PHx) ve 48 saat tedavi penceresi sağlayan asetaminofen (APAP) enjeksiyonları birleştirilerek geliştirilmiştir. Karaciğerin ortanca ve sol lateral lobları karaciğer kitlesinin %70'ini çıkarmak için çıkarıldı ve APAP'a 2 gün boyunca ameliyat sonrası 24 saat verildi. ALF'ye bağlı hayvanlarda sağkalımda ciddi azalma saptandı. ALF gelişimi alanin amino transferaz (ALT), aspartat amino transferaz (AST), alkalen fosfataz (ALP) enzimlerinin değiştirilmiş serum düzeyleri ile doğrulandı; protrombin zaman değişiklikleri (PT); ve uluslararası normalleştirilmiş oranın (INR) değerlendirilmesi. QPCR ile gen ekspresyonu profilinin incelenmesi, apoptoz, inflamasyon ve karaciğer hasarının ilerlemesinde yer alan genlerin ekspresyon düzeylerinde artış olduğunu ortaya koymuştur. Histolojik değerlendirme ile hepatositlerin diffüz dejenerasyonu ve immün hücrelerin infiltrasyonu gözlendi. AlF'nin geri döndürülemeoranı, sinjenezik sağlıklı sıçan hepatositlerinin intrasplenik transplantasyonu ndan sonra ALT, AST ve ALP'in sağkalım ve serum düzeylerinin restorasyonu ile doğrulandı. Bu model, ALF'nin patofizyolojisini incelemek ve ALF için yeni bir tedavinin potansiyelini değerlendirmek için mevcut ALF hayvan modellerine güvenilir bir alternatif sunmaktadır. İki farklı yaklaşımın kullanımı da fiziksel ve ilaca bağlı karaciğer hasarının kombine etkisini incelemek mümkün kılar. Mevcut yordamın tekrarlanabilirliği ve fizibilitesi modelin ek bir yararıdır.
Introduction
Akut karaciğer yetmezliği (ALF) Amerikan Derneği Karaciğer Hastalıkları Çalışma için herhangi bir hasar belirti olmadan akut karaciğer hasarının hızlı gelişimi olarak tanımlanır ve karaciğer ciddi bozulma ile karakterizedir, metabolik, ve karaciğer detoksifiye fonksiyonları1. ALF, uzun bir süre boyunca neden olduğu karaciğer hasarı ve ani karaciğer hasarı kronik karaciğerhastalıkları2 ,3,4sonucu gerçekleşir akut kronik karaciğer yetmezliği (ACLF), oluşur kronik karaciğer yetmezliği farklıdır . ALF için mevcut tek tedavi ortotopik karaciğer nakli (OLT), ya da ölüm oluşabilir. Karaciğer donör sıkıntısı nedeniyle, ALF muzdarip hastalarda mortalite oranı çok yüksektir.
Alternatif terapötik yaklaşımların potansiyelini incelemek ve ALF'nin patofizyolojisini daha iyi anlamak için, insanlarda meydana gelen ALF'yi yansıtabilen hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Zaten mevcut ALF hayvan modellerinin çoğu birkaç eksiklikleri var. Asetaminofen (APAP) etkileri nin çoğaltılması zordur ancak temporal, klinik, biyokimyasal ve patolojik parametreler açısından en yakın benzerliklere sahiptir. APAP kaynaklı hayvan modelleri sık sık APAP ve ara5,6,7hemoglobin oksidasyonu nedeniyle methemoglobine varlığı nedeniyle sorunlarla karşılaşır. Başka bir sorun öngörülemeyen doz yanıtları ve ölüm saati yansıyan tekrarlanabilirlik eksikliğidir. Karbon tetra klorür (CCl4)kullanılarak üretilen ALF hayvan modelleri8,9,10,11'de düşük tekrarlanabilirlik vardır. Konkavalin A (Con A) ve lipoplysaccharide (LPS) indüklenen ALF hayvan modelleri insan hastalığının klinik modelini yansıtmaz, onlar otoimmün karaciğer hastalıkları ve sepsis çalışmada sırasıyla dahil hücresel mekanizmaların çalışmada avantajları olmasına rağmen12,13,14,15. Benzer şekilde, tiyoacetamide (TAA) da aktif bir metabolit tiyoacetamide sülfoksit biyotransformasyon gerektirir ve türlerin varyasyongösterir 16,17,18,19. D-galaktosamin (D-Gal) bazı biyokimyasal üretir, metabolik, ve fizyolojik değişiklikler ALF benzer ama tüm ALF patolojik durumu yansıtmak mümkün değildir20,21,22,23. Daha iyi bir şekilde ALF sendromu yansıtmak mümkün bir ALF modeli geliştirmek için bu yöntemlerin iki veya daha fazla birleştirmek için çok az girişimleri olmuştur13. Bu nedenle, daha fazla çalışma hastalık parametrelerini yansıtabilir bir model geliştirmek için gereklidir, daha iyi tekrarlanabilirlik vardır, ve terapötik bir müdahalenin etkilerini incelemek için yeterli zaman sağlar.
Mevcut çalışmada, sıçanlarda alternatif bir ALF modeli parsiyel hepatektomi (PHx) ve hepatotoksik reaktifin daha düşük dozlarda etkileri birleştirilerek oluşturulmuştur. APAP karaciğer hasarına neden iyi kurulmuş bir role sahiptir5,24,25. Yaygın olarak kullanılan bir analjeziktir ve toksik metabolitler oluşturarak supratherapeutic dozlarda karaciğer için toksiktir. APAP gelişmiş ülkelerde birçok ölüm nedenidir. Kısmi hepatektominin neden olduğu fiziksel yaralanma, inflamasyonla ilgili çeşitli süreçlerin aktivasyonunun yanı sıra karaciğer rejenerasyonunu da başlatır. Hepatotoksik ajan APAP enjeksiyonu karaciğerde düşmanca bir ortama neden olur, hepatositlerin çoğalmasını önler. Bu hayvan üzerindeki stres süresini azaltır, hangi hepatotoksin daha küçük dozlarda ile kombine edildiğinde, prosedürün daha iyi tekrarlanabilirlik yol açar. Bu nedenle, bu model kullanılarak, karaciğer yaralanmaları iki tür bir kombinator etkisi çalışılmıştır. Geliştirilen ALF hayvan modelini karakterize etmek için fizyolojik ve biyokimyasal parametreler incelenmiştir. AlF'nin başarılı geri dönüşü sinjenezik sağlıklı sıçan hepatositlerinin transplantasyonu ile doğrulandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan prosedür, Yeni Delhi Ulusal İmmünoloji Enstitüsü Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Onay seri referans numarası IAEC#355/14'tür.
1. Hazırlık
- Das B ve ark.26tarafından daha önce açıklandığı gibi cerrahi işlem için hazırlanın.
- Vücut ağırlığı 200-250 g olan 6-8 haftalık inbred Wistar sıçanları kullanın.
- Standart hayvan bakım koşulları altında ev hayvanları ve işlem öncesi ve sonrası sıçan chow ve libitum ile beslemek.
- %70 PHx yaparken, intraperitoneal olarak enjekte edilen ketamin hidroklorür (100 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (10 mg/kg vücut ağırlığı) karışımını standart bir kokteyl karışımı kullanın.
NOT: Kullanılan anestezinin tipinin mortalite ve morbidite üzerinde postoperatif etkileri olabilir. - Hücre nakli sırasında, inhalant anestezi Isoflurane kullanın (2-kloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifloro-etan) transplantasyon ameliyatı sonrası hayvanın iyileşme süresini azaltmak için.
- Özelleştirilmiş bir anestezi sistemi kullanarak inhalasyon anestezisini teşvik edin ve bakımını koruyun. Oksijen akışını 4 L/dk'da koruyun. İndüksiyon kullanımı için %4, bakım kullanımı için %2-3 cerrahi işlem sırasında.
2. Ameliyat öncesi işlemler
- Adım 3.1 intraperitoneally açıklanan ketamin-ksilazin karışımı enjekte ederek sıçan anestezik. Hayvanın ayak parmaklarını çimdikleyerek tam anesteziyi onaylayın. Diğer işlemler sadece pedal refleksi olmadığında gerçekleştirilir.
- Kornea desiccation önlemek için, her iki göze karboksi metil selüloz bazlı göz damlası uygulayın.
- Anestezili hayvanı beyaz bant kullanarak cerrahi tahtaya kadar dizginleyin. Karın tarafı yukarı bakacak şekilde hayvanı yerleştirin, ameliyatı gerçekleştiren kişinin ağzının distal tarafta olmasını sağlar.
- Bir elektrikli makas kullanarak sağ üst karın cerrahi bölgesinden saç çıkarın.
- Cerrahi bölgeyi üç alternatif povione iyot ve %70 etanol ile sterilize edilmiş pamuk pedleri kullanarak dairesel hareketlerle dezenfekte edin.
3. Parsiyel hepatektomi (PHx) karaciğer kütlesinin% 70 kaldırmak için
NOT: Tüm cerrahi işlemi steril bir ortamda laminar akış kaputunda gerçekleştirin. Ameliyat sonrası enfeksiyon riskini en aza indirmek için sadece steril cerrahi aletler kullanın. Karaciğer kütlesinin% 70 çıkarılması, adlı 70% parsiyel hepatektomi (%70 PHx), C. Mitchell ve H. Willenbring, 200827tarafından açıklandığı gibi yapıldı .
- Ameliyat başlamadan önce, ayak parmaklarını çimdikleyerek hayvanın tam anestezisini onaylayın. Diğer işlemler sadece pedal refleksi olmadığında gerçekleştirilir.
- Sternumun hemen altında, xiphoid'e dik ve göğüs kafesine paralel olarak kesilecek deriyi işaretleyin.
- İşaretli deri üzerinde yaklaşık 3 cm x 1 cm açık lık olan steril bir örtü tabakası yerleştirin.
- Neşter ile işaretli çizgi boyunca yaklaşık 2-3 cm enine kesi yapın. 22 no'da cerrahi bıçak kullanın. Hafifçe steril nemlendirilmiş pamuk ipuçları kullanarak kesici alan çevresinde altta yatan kas tabakasına cilt eki kaldırın.
- Sonra, xiphoid sürecinin hemen altında periton tabakası ile bir enine kesi yapmak.
- İki tuzlu nemlendirilmiş pamuk uçları yardımıyla, toraks üzerinde nazik basınç uygulayarak karaciğersol lob ortaya çıkarmak. Karaciğer lobu yukarı kaldırmak için kesici bölgenin diyafragmatik bölgeye bir pamuk ucu ve incili bölgenin altına diğer pamuk ucunu yerleştirin.
- 8-10 cm uzunluğunda steril naylon iplik halkasını (boyut 4–0, 0.15 mm çapında) maruz kalan karaciğer lobunun etrafına kaydırın. Mikrodissecting forceps veya nemlendirilmiş pamuk tomurcukları yardımıyla hilum yakın lob tabanına döngü alın.
- Mikrocerrahi iğne tutucu ve mikrokops yardımıyla, döngü iki ucunu kravat, kan damarı daraltmak ve karaciğer lob çıkarıldıktan sonra kanamayı azaltmak için mümkün olduğunca lob tabanına yakın düğüm yerleştirerek. Diğer tarafta iki ek düğüm bağlayın.
- Aksi takdirde venöz obstrüksiyona (darlık) neden olabilir yakındaki kan damarları, çok yakın düğüm bağlamak için önlem alın.
- Düğümhemen üzerinde bağlı lob kesmek için mikrocerrahi makas kullanın, hangi lob yerine iskemik kütük denilen doku renksiz bir kitle bırakır.
NOT: Fare karaciğeri, fareler gibi, dört ayrı loba ayrılır: median lob, sağ lateral lob, sol lateral lob, ve kaudat lob, yaklaşık temsil eden 40%, 20%, 30%, ve 7% toplam karaciğer kütlesi, sırasıyla. Bu lobların herhangi bir kombinasyonu% 70 karaciğer kütlesi çıkarmak için kaldırılabilir. Bu çalışmada median lob ve sol lateral loblar çıkarıldı. - Sol lateral lobun kalan kütüğüne zarar vermeden ortanca lobu dikkatlice bulun. Yavaşça karın boşluğundan çekin, ve lob un tabanında daha önce belirtildiği gibi 8-10 cm uzunluğunda naylon iplik (boyut 4-0) düğüm kravat. Diğer tarafta iki ek düğüm bağlayın. Dikkatle çıkarmak ve belirtilen tüm önlemleri alarak bağlı medyan lob kaldırın.
- Lobları çıkardıktan sonra, periton dikiş sürekli dikiş ile emilebilir bir kromik 4-0 dikiş kullanarak ve ardından kesilen bir dikiş ile cilt dikiş.
- Enfeksiyonu önlemek için sütürleri çevreleyen cilde povison iyot uygulayın.
- Örtü tabakasını çıkarın ve hayvanı ameliyat panosundan çıkarın.
4. Hayvanlarda postoperatif bakım
- İntraperitoneal 1 mL glukoz çözeltisi 1 mL bir doz 12 mg sefotaksim antibiyotik ile 1 mL şırınga ile postoperatif enfeksiyon riskinden korumak için hayvan enjekte.
- Ameliyat sonrası ağrı kesici için analjezik meloksikam (1 mg/kg vücut ağırlığı) deri altı enjeksiyonuyguluyor ve rejimi günde bir doz olarak tutarak iki doz daha takip edin.
- 12 saat açık/karanlık döngü standart koşullar altında işletilen hayvanlar ev ve düzenli aralıklarla izlemek.
5. Karaciğer yetmezliğine neden olmak için kısmen hepatektomizlenmiş hayvanlarda ilaç enjeksiyonu
- 24 saat ameliyat sonrası hayvanlar %70 PHx'ten başarıyla iyileştiğinde, enjeksiyonları takip eden hayvanın vücut ağırlığını ölçün.
- Hayvanların cerrahi işlemden başarılı bir şekilde iyileşmesinden sonra %70 PHx'ten sonra kısmen hepatektomize edilmiş hayvanlara 750 mg/kg apap intraperitoneal olarak enjekte edin. 24 saat sonra tekrar dozu tekrarlayın.
NOT: İki doz APAP hayvana intraperitoneal olarak uygulanır (sırasıyla %70 PHx prosedüründen sonra 24 saat ve 48 saat). - APAP enjeksiyonundan sonra her zaman noktasında, iyileşen hayvanın vücut ağırlığını ölçün.
NOT: APAP (biyosetamol) hayvanlara %2 benzil alkolde 150 mg/mL çözelti olarak enjekte edilir.
6. ALF hayvan modellerinde sağlıklı hepatosit transplantasyonu
NOT: Sıçanlarda ALF'nin geri döndürülemezliğini incelemek için, ALF'ye bağlı hayvanlarda sağlıklı sinjenezik sıçan hepatositlerini apap 1dozile birlikte intrasplenik olarak nakledin. Mevcut çalışmada, homing ve engraftment için nakledilen hücrelere yeterli zaman sağlamak için, transplantasyon APAP 1doz verildikten hemen sonra yapıldı. Sıçan hepatositler ilk Berry ve Friends ve ark.28 tarafından yayınlanan bir protokol ile izole edilmiş ve daha sonra çeşitli diğer çalışmalarda uyarlanmış29,30,31 bazı değişiklikler ile. ALF hayvan modelindeki hücrelerin intrasplenik nakli için aşağıda belirtilen adımları izleyin.
- 250-350 g vücut ağırlığına sahip bir sıçan için% 4 izofluran ve 4 L / dk oksijen akışı ile anestezi indüksiyonu için bir poli (metil metakrilat) odasına sıçan yerleştirin. Hayvanın ayak sıkışma pedal refleksleri eksikliği ile anestezi derinliği kontrol edin.
- Anestezili sıçanı cerrahi tahtaya sol yan kısmı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Uygun bir ağızlık ile% 2-3 izofluran inhalasyon anestezi korumak.
- Sol lateral bölgede cilt tıraş ve povidon iyot çözeltisi ile sterilize.
- Derinin tıraş lı bölgesinde enine kesi yapın.
- Dalağını ortaya çıkarmak için periton tabakasında 1-2 cm'lik bir kesim yapın.
- Yavaşça periton boşluğunun dalak çıkarmak ve iki nemlendirilmiş pamuk ipuçları yardımıyla kaldırın.
- Hücreleri (genellikle hayvan başına 107) 50 μL IMDM ortamda 29 G iğne ile 1 mL insülin şırıngasında askıya alınacak şekilde tutun.
- İğneyi yavaşça dalak korteksine batırın ve hücre süspansiyonuna 2-3 dakika içinde dalak bırakın.
- Hücre nakli tamamlandıktan sonra, dikkatlice iğne çıkarmak ve bölgeden hücre süspansiyon sızıntısını önlemek için nemlendirilmiş bir pamuk ucu ile iğne delinme alanı dab.
- Periton ve cildi sırasıyla sürekli ve kesintisiz dikiş ile 4-0 emilebilir dikiş ile kapatın.
- Ameliyat edilen bölgede enfeksiyonu önlemek için sütürlerin yerine cilde povison iyot solüsyonu uygulayın.
- İntraperitoneal 1 mL hacim 12 mg/mL antibiyotik (örneğin, sefotaksim) çözeltisi enjekte ve subkutan analjezik enjekte (örneğin, meloksikam) 1 mg / kg vücut ağırlığı hayvana postoperatif bakım bir parçası olarak. Hayvanı sıcak bir kurtarma kafesine taşıyın.
- Ameliyat edilen hayvanı, cerrahi yaralar tamamen iyileşene kadar 12 saat açık/karanlık döngü normal koşullarda izole edin. Bu işlem 3-4 gün sürebilir.
7. ALF gelişiminin karakterizasyonu
- APAP tedavisinin2 doz undan sonra ketamin-ksilazin çözeltisi 2 saat aşırı doz ile hayvanları ötenazi ve kan ve doku örnekleri toplamak.
- Biyokimyasal çalışmalar için kandan serum toplamak32.
- Histolojik ve gen ekspresyonu çalışmaları için süreç karaciğer dokusu örnekleri33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ALF hayvan modellerinde sağkalım yüzdesi
APAP'ın alf'ye %70 PHx ile birlikte neden olan optimum dozu 750 mg/kg vücut ağırlığı olarak standartlaştırıldı. Tedavi rejimi% 70 PHx sonra 24 saat başladı, hayvanlar tamamen cerrahi kurtarıldı zaman, ve 24 saat aralıklarla iki APAP dozları oluşuyordu. Mortalite, ameliyat sonrası 48 saat olan Ikinci APAP dozu verildikten sonra %80 oranında gözlendi. Hayatta kalma yüzdesi Kaplan-Meier yöntemi ile analiz edilerek çizildi (Şekil 1). Bu modeltarafından sağlanan ölüm zamanı ve zaman diliminde tekrarlanabilirlik ALF karşı terapötik bir müdahale eğitimi için uygun bir aday yapar.
Çalışmaya dört grup hayvan düşünüldü: Grup 1 (kontrol grubu, sadece tuzlu tedavi), Grup 2 (sadece 750 mg/kg vücut ağırlığında apap), Grup 3 (% 70 PHx ile salin tedavisi) ve Grup 4 (APAP 750 mg/kg vücut ağırlığı ile 70% PHx). Tüm gruplara üçer hayvan dahil edildi ve her gruptan iki temsili resim yer aldı. Dört gruptan hayvanlar, tedavinin2. Dört gruptan alınan karaciğer örnekleri birbirinden farklı morfoloji gösterdi. Grup 1 sağlıklı bir kemirgen karaciğerkırmızım-kahverengi morfolojigösterdi. Grup 2'nin karaciğer örnekleri morfolojik düzeyde belirgin bir hasar belirtisi göstermedi ve Grup 1'in sağlıklı karaciğerlerine benzer bir görünüm gösterdi. Grup 3 ve 4'ten alınan karaciğer örnekleri sağlıklı görünmedi ve renk değişikliği ve yamalı bir görünüme sahipti. Renk değişikliği karaciğer dokusundaki hasara tekabül eder ve Grup 4'te daha belirgindir. Temsili veriler Şekil 2'desunulmuştur.
Karaciğer hasarının derecesi ALT, AST ve ALP enzimlerinin serum düzeyleri kontrol edilerek belirlendi36,37,38. ALT, AST ve ALP düzeyleri, karaciğer hasarının derecesine karşılık gelen dört grup arasında belirgin farklılıklar gösterdi. Grup 4, AST ve ALP düzeylerinde Grup 1'e göre anlamlı bir artış gösterdi(Şekil 3).
Kontrol ve ALF kaynaklı gruplarda gen ekspresyonu profilini karşılaştırmak için, hücre ölümü ile ilgili genlerin q-PCR analizi(Bax2, Caspase3, Fas) karaciğer dokusu örneklerinde35,39. Grup 1'e göre grup 3'te güncellenen bu tespitlerde, Grup 2 ve Grup 4'te fark görülmedi. Karaciğer hasarına yanıt olarak aşırı ifade edildiği bilinen genlerin(Mcp1 ve Mmp2)33,40 kontrol Grubu 1'e göre her üç grupta da güncellendiği saptandı. Grup 3 ve 4'te mmp9 düzenlenirken, Grup 2 kontrol Grubu 1'den belirgin bir fark göstermedi. Grup 3'te Timp1 ve Timp234 ekspresyon düzeyleri daha yüksek bulundu ancak Grup 4'te belirgin bir aşırı ifade saptanmama(Şekil 4).
Karaciğer iltihabında rol oynayan genlerin(Tnfa, IL1a, Tgfbr1 ve IL1b)41,42,43,44 kontrol Grubu 1'e göre Grup 3'te aşırı ekspresyon olduğu saptandı ancak grup 4'te ifade düzeyleri düşürüldü. ALR karaciğer hasarı indüksiyon sonra karaciğer dokusunda aşırı ifade edilir. Bu genin akıntıdaki basamakları karaciğer yenilenmesine yardımcı olur. APAP kaynaklı toksisitede RIP1 proteini gereklidir. ALR ve RIP1'in grup 1'e göre Grup 2 ve 3'te upregulated olduğu, grup 1'de ise düzeylerinin grup 4'te benzer veya daha düşük olduğu saptadı. Alfa düz kas aktinini(aSMA),fibrozise yol açan aşırı ECM birikiminin bir belirteci, Grup 3 ve 4'te kontrol Grubu 1'e göre upregulated olduğu bulunmuştur (Şekil 4). Gen ekspresyonu verileri, karaciğer hasarı sırasında aşırı eksprese edildiği bilinen inflamasyon ve hücre ölümünün yukarıda bahsedilen biyobelirteçlerinin, ALF'nin önerilen yöntemle indüklendiği hayvanların karaciğer doku örneklerinde düzenlendiğini ve böylece moleküler düzeyde karaciğer hasarının meydana geldiğini doğruladığını göstermektedir.
Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama
Hematoksilin ve eozin (H&E) boyanması hepatosit dejenerasyonunun derecesini gözlemleyerek karaciğer hasarının şiddetini değerlendirmek için yapıldı. H&E ile boyanmış karaciğer doku bölümleri üçüncü bir şahıs tarafından kör analize tabi tutuldu. %70 parsiyel hepatektomi grubunda veziküler yağ dejenerasyonu gözlendi ve asetaminofen grubunda periportal inflamasyon ve nekroz hafif sinüzoidal dilatasyon ile birlikte görüldü. Vesiküler yağ dejenerasyonu daha çok ALF grubunda gözlendi (Şekil 5).
Protrombin zamanı ve kan şekeri düzeyleri
Protrombin Zamanı (PT) karaciğerde sentezlenen doku tromboplastinin aktivitesine bağlı bir parametredir ve kan pıhtılaşma mekanizmasının verimliliğini karakterize etmek için kullanılır45. Genel olarak karaciğere bağlı hastalıkların koşullarında PT'de artış gözlenir. KONTROL grubuna göre ALF'ye bağlı grupta PT'nin anlamlı olarak daha yüksek olduğu saptandı. Uluslararası normale oranı (INR)45 de daha yüksek bulundu, verimsiz karaciğer fizyolojisi sonucu kan pıhtılaşma mekanizmasında bir kusur temsil eden(Şekil 6).
Hücre sağlıklı singenik sıçan hepatosit transplantasyonu sonrası sağkalım değerlendirilmesi
ALF modelinin önemli bir kriteri terapötik bir müdahale varlığında karaciğer yetmezliğinin geri döndürülemesidir. Bu çalışmada, hücre nakli tedavisinin karaciğer yetmezliği üzerindeki etkisini gözlemlemek için 10 milyon sağlıklı singenik sıçan hepatositi instrasplenik olarak nakledilmiştir. Nakledilecek hücrelerin uygun sayısı, farklı hücre numaralarının naklinden sonra karaciğer yetmezliğinin geri döndürülebilirliği gözlemlenerek belirlendi (veriler gösterilmedi). Hücreler APAP'ın 1st dozu verildikten sonra nakledildi ve hücrelerin naklinden sonra hayvanlarda sağkalım geri getirildi(Şekil 7). ALT, AST ve ALP enzimlerinin serum düzeylerinin 10 günlük hücre naklinden sonra normale döndürüldebildi(Şekil 8).
Şekil 1: ALF'ye bağlı grupta sağkalım yüzdesi. Kaplan-Meier Survival Curve% 70 PHx ve APAP dozu (750 mg / kg vücut ağırlığı) kombinasyonu ile ALF indüksiyonu sonrası hayvanların sağkalım yüzdesini gösteren. Zaman 0 h% 70 PHx süresini gösterir. APAP'ın1 ve2 dozları ameliyat sonrası 24 ve 48 saat (n = 12, toplam hayvanlar) uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Çalışmaya dahil edilen dört farklı grupta karaciğer morfolojisinin temsili görüntüleri. Görüntü panelleri A-D, ilgili tedavinin 2dozundan sonra 2 saat ötenazi yedikten sonra farklı grupların karaciğerlerinin morfolojisini göstermektedir. (A) Sadece tuzlu verilen kontrol Grubu 1'in karaciğer morfolojisi. (B) Grup 2'nin karaciğer morfolojisi olan 750 mg/kg vücut ağırlığı dozunda sadece APAP verilir. (C) Grup 3'ün %70 PHx.(D) Grup 4'te karaciğer morfolojisi verildiği grup 3'ün karaciğer morfolojisi Grup 3'e benzer dozda %70 PHx (grup başına n = 3 hayvan) olarak verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Serumun farklı gruplardaki biyokimyasal profilinin karşılaştırılması. Çubuk grafikler, çalışmaya dahil edilen dört grubun serum örneklerinde ALT, AST ve ALP'in ortalama değerini temsil eder. Serum, tedavinin 2dozundan sonra 2 saat olarak alındı. Hata çubukları = S.E.M; = p < 0.001; * = p < 0.05; n = 3 olarak Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Karaciğer dokusu örneklerinin gen ekspresyonu profili. Çubuk grafikler, farklı tedavilere tabi tutulan dört grupta inflamasyon ve hücre ölümü ile ilgili çeşitli genlerin mRNA ekspresyonunun göreceli niceliğini temsil eder. Tüm genler kontrol Gapdhifadesine karşı normalize edildi. Hata çubuğu = üç farklı örneğin standart hata ortalaması (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Karaciğer dokusu örneklerinin histolojik çalışması. Çalışmada yer alan dört gruptan alınan karaciğer doku örneklerinin temsili hematoksilin ve eozin boyama görüntüleri, parlak alan mikroskobunda 200x büyütme altında gözlenmiştir. Kontrol Grubu 1'de hafif periportal infiltrasyonu (yeşil oklar) olan normal hepatositler çoğunlukla normal idi. Grup 3'te (%70 parsiyel hepatektomi) vesikal yağ dejenerasyonu gözlendi (beyaz oklar) ve asetaminofen Grup 2 periportal inflamasyon (kırmızı oklar) ve nekroz hafif sinüzoidal dilatasyon (sarı oklar) ile birlikte görüldü. Makrovesiküler yağ dejenerasyonu çoğunlukla ALF Grup 4'te (turuncu oklar) gözlendi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Protrombin zamanı (PT) ve uluslararası normalleştirilmiş oranın (INR) karşılaştırılması. (A) PT'nin kontrol Grubu 1 (tuzlu enjeksiyon sonrası %70 PHx) ile ALF'ye bağlı Grup 4 (APAP enjeksiyon sonrası %70 PHx) arasında karşılaştırılması. Kan, ilgili tedavinin 2dozundan sonra 2 saat toplandı ve fibrin pıhtı oluşumu için gerekli olan süre (saniye cinsinden) Y ekseninde gösterilmiştir (**** = p < 0.0001, n = 5). (B) ALF'nin neden olduğu Grup 4'teki INR, kontrol Grubu 1'e göre 1. Grup 4'teki INR'ın ortalama değeri 2.28 olarak bulundu ve bu değer Warfarin kaynaklı anti koagülasyon etkisine denk geliyor (n = 5). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Hücre nakli sonrası ALF'ye bağlı grupta sağkalım yüzdesi. Kaplan-Meier sağkalım eğrisi, ALF'ye bağlı Grup 4'te sağlıklı hepatosit transplantasyonu sonrası sağkalım yüzdesini kontrol Grup 1'e göre gösterir (n = 5). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Hücre nakli sonrası ALF'ye bağlı hayvanların serum biyokimyasal profili. Alf'ye bağlı hayvanların serum düzeyleriile karşılaştırıldığında hücre naklinden 10 gün sonra ALT, AST ve ALP enzimlerinin serum düzeyleri 2doz APAP uygulamasından sonra ötanazi yapılır. Hata çubuğu = beş farklı örnek ortalamasının standart hatası; = p < 0.0001; ** = p > 0,01; n = 5 olarak Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ALF için uygun bir hayvan modelinin geliştirilmesi patogenezin daha iyi anlaşılması ve ALF'nin ilerlemesi için çok önemlidir. Iyi karakterize ALF hayvan modeli de alf karşı yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi ve deneme için fırsat sağlar. Birçokgirişimalf6,12, 21,23,46,47,48klinik olarak ilgili bir model geliştirmek için yapılmıştır. Bu çalışmaların çoğu ya cerrahi prosedürleri kullanmak ya da hepatotoksik kimyasallar tarafından karaciğer hasarı neden.
PHx nekrotik ve apoptotik dokuların neden olduğu inflamasyon yokluğu nedeniyle ALF patolojisini yansıtmaz çünkü PHx tarafından tek başına bir ALF modeli oluşturmak zordur. Terapötik dozlarda, APAP glucoronidation ve sülfit süreçleri ile tamamen metabolize edilir. Yüksek dozlarda, bu yollar doygun olduğunda, APAP öncelikle hepatositler tarafından sentezlenen sitokrom p450 enzimleri tarafından metabolize edilir, toksik bir ara oluşumu ile sonuçlanan, NAPQI (N-asetil-p-benzoquinone amin). Normal şartlar altında NAPQI hücrelerin glutatyon (GSH) rezervleri tarafından nötralize edilir, supraterapötik dozlarda ise hepatositlerde oksidatif strese neden olur, hepatosit ölüm ile sonuçlanan4,24,25,46. Bu nedenle, % 70 PHx ve APAP kaynaklı karaciğer hasarıfizyolojik etkileri birleştirerek, bir ALF sıçan modeli mevcut çalışmada oluşturuldu. Daha küçük bir tedavi penceresi hayvan üzerindeki stres süresini azaltır. APAP daha küçük dozlarda ile kombine edildiğinde, Bu prosedürün daha iyi tekrarlanabilirlik yol açar.
APAP dozu, hayvana terapötik müdahalenin sağlanabileceği uygun bir tedavi penceresi sağlamak için seçilmiştir (yani,1 dozun 48 saat iveci nde ve 2dozun 24 saat). APAP'ın 2dozundan sonra 24 saat içinde %100 mortalite gözlendi. Ancak, bu süre içinde ölüm zamanı her hayvan için değişkendi. Bu nedenle, ALF gelişimini incelemek amacıyla, hayvanlar APAP2 doz sonra 2 saat standart bir zaman noktasında ötenazi edildi.
Terapötik müdahalenin zamanı, bireysel çalışmaya ve çalışılan tedavinin türüne bağlı olarak belirlenebilir, bu çalışmada sinjenesik sıçan hepatositlerinin apr dozdan hemen sonra nakli, hücrelerin eve ve engrefte yeterli zaman almasına olanak sağlar. Mevcut modelde, ALF'den başarılı bir kurtarma için en az 10 milyon hücre nakli gerekmektedir.
Cerrahi işlemin başarısını sağlamak için birkaç önemli nokta göz önünde bulundurulmalıdır. Farklı cerrahi işlemlerde farklı anestezik türlerinin kullanılması tavsiye edilir. Kısmi hepatektomi yapmak için, ketamin-ksilazin bir kokteyl cerrahi prosedürü tamamlamak için yeterli zaman verir, çünkü önerilen dozlarda kullanılmalıdır. Hücre nakli sırasında, ALF'ye bağlı hayvanlar üzerindeki fiziksel stresi azalttığı için inhale edilebilir anestezi isofluran kullanılmalıdır.
Sonuç olarak, tek tip mortalite oranı ve uygun bir tedavi penceresi nedeniyle ALF'nin hücre transplantasyonu ile geri döndürülemeoranını incelemek için APAP ve %70 PHx kombine modeli kullanılmıştır. ALF'nin geri döndürülebilirliğini değerlendirmek için ALF'ye bağlı hayvanlarda 10 milyon sağlıklı singenik sıçan hepatositi intrasplenik olarak nakledildi. Transplantasyon sonrası ALF'ye bağlı hayvanlarda sağkalım oranının arttığı saptandı. Hücre nakli sonrası hayvanlarda da ALT, AST ve ALP serum düzeylerinde iyileşme gözlendi ve karaciğer metabolizmasının onarıldığını düşündürdü. Bu ALF hayvan modeli, akut karaciğer yetmezliği ve karaciğer nakli arasındaki boşluğu dolduran hücrelerin terapötik potansiyelini değerlendirmek için bir alternatif sunar. Aynı zamanda fiziksel yaralanma ve hepatotoksik ajan ın neden olduğu karaciğer hasarı çalışma fırsatı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Biyoteknoloji Bölümü, Hindistan Hükümeti Ulusal İmmünoloji Enstitüsü, Yeni Delhi alınan çekirdek hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, Suppl 2 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
