세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화
Summary
이 방법은 배양 된 세포 및 동물 조직에서 샘플 준비를 설명하고, 샘플에서 코엔자임 A의 추출 및 유도체화를 설명하고, 유도된 코엔자임 A의 정제 및 정량화를 위한 고압 액체 크로마토그래피를 흡광도 또는 형광 검출.
Abstract
신흥 연구는 세포 코엔자임 A (CoA) 공급이 성장, 신진 대사 및 생존에 해로운 영향을 미치는 제한될 수 있음을 밝혔습니다. 세포 CoA의 측정은 상대적으로 낮은 풍부함과 무료 CoA를 CoA 티에스테르로의 동적 변환으로 인해 도전이며, 차례로 수많은 대사 반응에 참여합니다. 많은 생물 의학 실험실에서 사용하기에 적합한 검출의 넓은 선형 범위와 분석법을 산출하기 위해 샘플 준비 동안 잠재적 인 함정을 탐색하는 방법이 설명된다.
Introduction
코엔자임 A (CoA)는 모든 살아있는 유기체의 필수 보조 인자이며 판토테네이트 (판토테닉 산의 소금) 또는 비타민 B5라고도하는 판토테산산에서 합성됩니다. CoA는 아세테이트와 숙시네이트와 같은 짧은 사슬 산, 프로피오네이트 및 메틸말로네이트와 같은 분기 사슬 산, 팔미테이트 및 올레테이트와 같은 긴 사슬 지방산, 매우 긴 사슬 지방산과 같은 유기산의 주요 세포 내 담체입니다. 고도 불포화 지방산, 및 valproic 산과 같은 xenobiotics. 유기산은 CoA와 동위적으로 티오에스테르 연계를 형성하여 중간 물질 대사에서 100개 이상의 반응에서 기질로서의 사용을 가능하게 한다1. CoA 티에스터는 또한 알로스테릭 조절제 및 전사 활성제입니다. 그것은 지금 평가2 셀룰러 총 CoA 공급규제3,4; 따라서, CoA 가용성은 제한될 수 있고, CoA 결핍은 CoA생합성5에영향을 미치는 유전적 무질서에 의해 예시된 바와 같이 치명적일 수 있다. 판토테네이트 키나아제는 CoA 생합성의 첫 번째단계(도 1)와판토테네이트 키나아제 관련 신경변성, PKAN이라고 불리며, PANK2 유전자6의돌연변이에 의해 유발된다. COASYN 유전자에 의해 인코딩된 CoA 신타제는 CoASYN 유전자의 마지막 두 단계를촉매(그림 1)및 COASY 단백질 관련 신경 변성이라고 하며, COASYN 유전자7의돌연변이에 의해 유발된다. PKAN과 CoPAN 은 모두 뇌의 철분 축적과 관련된 신경 퇴행성 질환과 CoA 결핍이 질병 병리의 밑에 유전됩니다.
총 CoA의 세포 수준은조직 8및 총 CoA가 다양한 생리학적, 병리학적 및 약리학적 상태 하에서 증가 또는 감소할 수 있다. 간 CoA는 공급 상태에서 급식 상태9로연료 전환 시 증가하고, 간 CoA 수준은 렙틴 결핍 비만 마우스10에서비정상적으로 높다. 간 CoA는 만성 에탄올 섭취에 반응하여감소11. Pank2 녹아웃 마우스 모델에서뇌 CoA 수준은 주산기 동안 우울하지만, 이후 성인 단계에서 뇌 CoA 함량은 야생형 수준과 동일하며, 개발 시 적응형 CoA 반응을 나타낸다12. 유전자 발생 또는 유전자 전달 방법에 의한 조직 CoA 함량의 조작은 대사 및 신경 기능에 영향을 미치는13,14,15. PKAN 또는 CoPAN에 대한 잠재적 치료법의 전임상 개발은 효능16,17,18,19,20의 지표로서 세포 또는 조직 CoA 측정을 포함한다. . 이러한 모든 조건및 이들의 대사 또는 기능적 결과에 대한 평가는 총 CoA의 측정을 위한 정량적 방법을 요구한다.
생물학적 시료에서 CoA를 측정하기 위한 정확하고 신뢰할 수 있는 분석방법은 많은 실험실에서 기술적 과제입니다. 불행하게도, 천연 CoA 티에스테르의 유사체가 효소21을활용하는 CoA 에스테르의 연구에서 기계론적 프로브로 널리 사용되어 왔지만, 손상되지 않은 세포에서 CoA 또는 CoA 티에스테르를 평가하거나 정량화하는 데 사용할 수 있는 프로브는 없습니다. CoA의 변환, 자유 설피 드릴 (-SH) moiety, CoA 티오 에스터 (또는 그 반대의 경우도 마찬가지)는 다른 환경으로 전송하는 동안 세포 또는 동물 조직에서 신속하고 세포 용해 동안. 세포에 있는 수많은 acyl-CoA 합성및 아실 CoA 티에스테르아제는 CoA 풀 내의 상호 변환을 중재하고, 기질로 CoA 티에스테르를 이용하는 추가 효소는 화학적 또는 물리적으로 담금질될 때까지 생물학 견본에서 활성 상태로 남아 있습니다 의미. 아실 트랜스퍼라제에 의한 CoA에서 카르니틴으로의 아실-그룹의 오프로딩은 CoA/CoA 티오에스테르 분포를 변경할 수 있는 반응 네트워크 내의 한 예입니다. 방사성 추적자는 세포에서 CoA 합성의 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 생물학적 샘플에서 CoA 및 CoA 유도체를 측정하는 현재 의 방법은22를 검토되었으며 결합된 효소 분광광도 분석법, 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법 기반 절차를 포함합니다. 그러나, 이러한 방법은 종종 특정 CoA 분자 종에 초점을 맞추고 전체 CoA 풀의 변화에 장님입니다. 결합된 효소 해석은 일반적으로 낮은 검출 감도로 인해 더 많은 양의 입력 물질을 필요로 하며 선형성이 제한적입니다.
우리의 실험실은 배양 된 세포와 동물 조직에서 총 CoA를 정량화하기위한 신뢰할 수있는 절차를 개발했습니다. 이 전략에는 CoA 종의 전체 스펙트럼을 유지하고 분석하기 위한 노력을 하기보다는 시료 준비 중에 무료 CoA만 을 산출하는 모든 CoA 티에스테르의 가수분해가 포함됩니다. 이 절차는 샘플 준비, CoA 유도화, 고압 액체 크로마그래피(HPLC) 및 흡광도에 의한 유도된 CoA의 정량화에 따른 개별 공표 방법의 편집입니다. 형광 검출23,24,25. 이 절차를 사용하여 얻은 CoA 결정은 CoA 규정의 우리의 이해와 CoA 결핍의 처리를 위한 치료 접근의 발달을 가능하게 했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 흡수 또는 형광 출력 검출기를 가진 HPLC가 있는 많은 실험실에서 접근할 수 있는 광범위한 선형 검출을 가진 세포 및 동물 조직에서 총 CoA를 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 단계별 절차를 보여줍니다. 양자택일로, 질량 분석법은 CoA와 CoA 티에스테르를 평가하기 위한 일반적인 기술입니다, 그러나 계측의 비용 및 방법론의 발달 및 데이터의 해석을 위해 요구된 전문화한 지식 때문?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 CoA 치료, Inc., BridgeBio LLC의 자회사, 건강 보조금 GM34496의 국립 연구소, 그리고 미국 레바논 시리아 관련 자선 단체에 의해 제공되는 후원 연구에 대한 자금을 인정.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
Riferimenti
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