Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti
Summary
Questo metodo descrive la preparazione del campione da cellule coltivate e tessuti animali, l’estrazione e la derivazione del coenzima A nei campioni, seguita dalla cromatografia liquida ad alta pressione per la purificazione e la quantificazione del coenzima derivato A da rilevamento dell’assorbimento o della fluorescenza.
Abstract
La ricerca emergente ha rivelato che l’offerta di coenzenzima cellulare A (CoA) può diventare limitante con un impatto negativo sulla crescita, il metabolismo e la sopravvivenza. La misurazione del CoA cellulare è una sfida per la sua relativamente bassa abbondanza e la conversione dinamica di CoA gratuita a CoA thioesters che, a sua volta, partecipano a numerose reazioni metaboliche. Viene descritto un metodo che naviga attraverso potenziali insidie durante la preparazione del campione per produrre un saggio con un’ampia gamma lineare di rilevamento che è adatto per l’uso in molti laboratori biomedici.
Introduction
Il coenzima A (CoA) è un cofattore essenziale in tutti gli organismi viventi ed è sintetizzato dall’acido panttheico, chiamato anche panttheanato (il sale dell’acido pantonico) o vitamina B5. Il CoA è il principale vettore intracellulare di acidi organici, compresi gli acidi a catena corta come acetato e succinato, acidi a catena di rami come propionato e metilmalo, acidi grassi a catena lunga come palmitato e oleato, acidi grassi a catena molto lunga come acidi grassi polinsaturi e xenobiotici come l’acido valproico. L’acido organico forma un collegamento tioester enzimaticamente con CoA per consentire il suo uso come substrato in oltre 100 reazioni nel metabolismo intermedio1. I tioesteri coA sono anche regolatori allosterici e attivatori trascrizionali. Ora è apprezzato2 che la fornitura totale cellulare di CoA è regolata3,4; pertanto, la disponibilità di CoA può essere limitante e le carenze di CoA possono essere catastrofiche, come esemplificato da disturbi genetici ereditari che hanno un impatto sulla biosintesi coa5. Pantothenate chinaase catalizza il primo passo nella biosintesi coa (Figura 1) e Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, chiamato PKAN, è causata da mutazioni nel gene PANK2 6. La sintesi della CoA, codificata dal gene COASYN, catalizza gli ultimi due passaggi nella biosintesi CoA (Figura 1) e nella Neurodegenerazione associata alle proteine COASY, chiamata CoPAN, è causata da una mutazione nel gene COASYN 7. Sia PKAN che CoPAN sono malattie neurodegenerative ereditarie associate all’accumulo di ferro nel cervello e alle carenze di CoA in modo inferiore alle patologie.
I livelli cellulari di CoA totale variano tra i tessuti8 e CoA totale può aumentare o diminuire sotto una varietà di stati fisiologici, patologici e farmacologici. Il CoA del fegato aumenta durante il passaggio del combustibile dallo stato di alimentazione allo stato digiunato9e i livelli di CoA epatica sono anormalmente elevati nei topi obesi carenti di leptina10. Fegato CoA diminuisce in risposta all’ingestione cronica di etanolo11. I livelli di CoA cerebrale nel modello di topo knockout Pank2 sono depressi durante il periodo perinatale, ma più tardi nella fase adulta il contenuto di CoA del cervello è equivalente ai livelli di tipo selvaggio, indicando una risposta CoA adattiva durante lo sviluppo12. Manipolazione del contenuto di CoA dei tessuti mediante transgenesi o metodi di somministrazione genica influisce sulle funzioni metaboliche e neurali13,14,15. Lo sviluppo preclinico di potenziali terapie per PKAN o CoPAN include misurazioni CoA cellulari o tissutali come indicatori di efficacia16,17,18,19,20 . La valutazione di tutte queste condizioni e delle loro conseguenze metaboliche o funzionali richiede un metodo quantitativo per la misurazione del CoA totale.
Un test accurato e affidabile per misurare CoA in campioni biologici è una sfida tecnica in molti laboratori. Purtroppo, non ci sono sonde disponibili per valutare o quantificare i tioesteri CoA o CoA in cellule intatte, anche se analoghi di tioesters CoA naturali sono stati ampiamente utilizzati come sonde meccanicistiche negli studi di CoA ester utilizzando enzimi21. La conversione di CoA, con un solfuro libero (-SH), in un tifoso di CoA (o viceversa) è rapida nelle cellule o nei tessuti animali durante il trasferimento in un ambiente diverso e durante la lisi cellulare. Numerosi sintetasi acyl-CoA e tioesterai di CoA nelle cellule mediano le interconversioni all’interno del pool di CoA, e ulteriori enzimi che utilizzano il tioestro coa come substrati rimangono attivi in campioni biologici fino a quando non vengono spenti da prodotti chimici o fisici mezzo. L’off-loading dei gruppi acili dal CoA alla carnitina da parte dei transferasi di acyl è un esempio all’interno della rete di reazioni che possono alterare la distribuzione di coA/CoA thioester. I traccianti radioattivi possono essere utilizzati per misurare i tassi di sintesi CoA nelle cellule. Gli attuali metodi per misurare i derivati di CoA e CoA in campioni biologici sono stati esaminati22 e includono saggi spettrofotometrici enzimatici accoppiati, cromatografia liquida ad alta pressione e procedure basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, questi metodi sono spesso focalizzati su particolari specie molecolari di CoA e sono ciechi alla variazione della piscina totale di CoA. I saggi enzimatici accoppiati generalmente richiedono grandi quantità di materiale di input a causa di basse sensibilità di rilevamento e hanno una gamma limitata di linearità.
Il nostro laboratorio ha sviluppato una procedura affidabile per la quantificazione del CoA totale nelle cellule coltivate e nei tessuti animali. La strategia include l’idrolisi di tutti i tioesteri CoA per produrre solo CoA gratuito durante la preparazione del campione, piuttosto che fare sforzi per mantenere e analizzare l’intero spettro delle specie CoA. La procedura è una compilazione di singoli metodi pubblicati per la preparazione dei campioni, la derivazione del CoA, la purificazione e l’identificazione a seguito della cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e la quantificazione della CoA derivata mediante assorbimento o rilevamento della fluorescenza23,24,25. Le determinazioni CoA ottenute utilizzando questa procedura hanno permesso la nostra comprensione della regolazione CoA e lo sviluppo di un approccio terapeutico per il trattamento delle carenze di CoA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui dimostriamo una procedura affidabile e graduale per quantificare il CoA totale nelle cellule e nei tessuti animali con un’ampia gamma di rilevamenti lineari accessibili in molti laboratori che hanno un HPLC con un rilevatore di uscita di assorbimento o fluorescenza. In alternativa, la spettrometria di massa è una tecnica comune per la valutazione dei tioesteri CoA e CoA, ma non è ampiamente disponibile a causa del costo della strumentazione e delle conoscenze specialistiche necessarie per lo sviluppo della metodolo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono i finanziamenti per la ricerca sponsorizzata fornita da CoA Therapeutics, Inc., una filiale di BridgeBio LLC, la sovvenzione national Institutes of Health GM34496 e gli American Lebanese Syrian Associated Charities.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
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