Quantification de la coenzyme A dans les cellules et les tissus
Summary
Cette méthode décrit la préparation d’échantillons à partir de cellules cultivées et de tissus animaux, l’extraction et la dérivatisation de la coenzyme A dans les échantillons, suivie s’il y a une chromatographie liquide à haute pression pour la purification et la quantification de la coenzyme Dérivée A par détection de l’absorption ou de la fluorescence.
Abstract
La recherche émergente a indiqué que l’approvisionnement en coenzyme a (CoA) cellulaire peut devenir limitant avec un impact préjudiciable sur la croissance, le métabolisme et la survie. La mesure du CoA cellulaire est un défi en raison de son abondance relativement faible et de la conversion dynamique de CoA libre en thioesters CoA qui, à leur tour, participent à de nombreuses réactions métaboliques. Une méthode est décrite qui navigue à travers les pièges potentiels pendant la préparation de l’échantillon pour produire un essai avec une large gamme linéaire de détection qui convient à une utilisation dans de nombreux laboratoires biomédicaux.
Introduction
Coenzyme A (CoA) est un cofacteur essentiel dans tous les organismes vivants et est synthétisé à partir d’acide pantothénique, également appelé pantothénate (le sel d’acide pantothénique) ou vitamine B5. Le CdA est le principal vecteur intracellulaire d’acides organiques, y compris les acides à chaîne courte comme l’acétate et le succinate, les acides à chaîne comme le propionate et le méthylmalonate, les acides gras à longue chaîne comme le palmitate et l’oleat, les acides gras à très longue chaîne tels que les acides gras à très longue chaîne tels que acides gras polyinsaturés, et les xénobiotiques tels que l’acide valproïque. L’acide organique forme un lien de thioester enzymatiquement avec CoA pour permettre son utilisation comme substrat dans plus de 100 réactions dans le métabolisme intermédiaire1. Les thioesters CoA sont également des régulateurs allostériques et des activateurs transcriptionnels. Il est maintenant apprécié2 que l’offre totale cellulaire DeA est réglementée3,4; ainsi, la disponibilité de CoA peut être limitante, et que les insuffisances de CoA peuvent être catastrophiques, comme illustré par les désordres génétiques hérités qui ont un impact coadsynthèse5. Pantothenate kinase catalyse la première étape de la biosynthèse CoA (Figure 1) et Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, appelé PKAN, est causée par des mutations dans le gène PANK2 6. La synthase CoA, codée par le gène COASYN, catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse coA (Figure 1) et de la neurodégénérescence associée aux protéines COASY, appelée CoPAN, est causée par une mutation du gène COASYN 7. Les deux PKAN et CoPAN sont des maladies neurodégénératives héréditaires associées à l’accumulation de fer dans le cerveau et les carences de CoA sous-en-plan les pathologies de la maladie.
Les niveaux cellulaires de CoA total varient entre les tissus8 et le CoA total peut augmenter ou diminuer sous une variété d’états physiologiques, pathologiques et pharmacologiques. Liver CoA augmente lors du passage du carburant de l’état nourri à l’état à jeun9, et les niveaux de CoA du foie sont anormalement élevés chez les souris obèses déficientes en leptine10. Le CoA du foie diminue en réponse à l’ingestion chronique d’éthanol11. Les niveaux de CoA du cerveau dans le modèle de souris Kok2 Pank2 sont déprimés pendant la période périnatale, mais plus tard dans le stade adulte, la teneur en CoA du cerveau est équivalente aux niveaux de type sauvage, ce qui indique une réponse adaptative de CoA pendant le développement12. La manipulation de la teneur en CoA tissulaire par la transgenèse ou les méthodes d’administration de gènes a un impact sur les fonctions métaboliques et neuronales13,14,15. Le développement préclinique de thérapies potentielles pour PKAN ou CoPAN inclut des mesures de CoA de cellules ou de tissu comme indicateurs de l’efficacité16,17,18,19,20 . L’évaluation de toutes ces conditions et de leurs conséquences métaboliques ou fonctionnelles exige une méthode quantitative pour mesurer le CoA total.
Un analyse précis et fiable pour mesurer le CoA dans les échantillons biologiques est un défi technique dans de nombreux laboratoires. Malheureusement, il n’y a pas de sondes disponibles pour évaluer ou quantifier les thioesters CoA ou CoA dans les cellules intactes, bien que les analogues des thioesters naturels de CoA aient été largement utilisés comme sondes mécanistes dans les études de l’ester de CoA utilisant des enzymes21. La conversion de CoA, avec un masydryle libre (-SH) moiety, à un thioester CoA (ou vice versa) est rapide dans les cellules ou les tissus animaux lors du transfert vers un environnement différent et pendant la lyse cellulaire. De nombreuses synthétases acyl-CoA et thioestérases acyl-CoA dans les cellules servent de médiateur sa part aux interconversions au sein du pool CoA, et d’autres enzymes qui utilisent des thioesters CoA comme substrats restent actifs dans les échantillons biologiques jusqu’à ce qu’ils soient éteints par des produits chimiques ou physiques. moyen de. Le déchargement des groupes d’acyl de CoA à carnitine par acyl-transferases est un exemple dans le réseau de réactions qui peuvent modifier la distribution de thioester CoA/CoA. Les traceurs radioactifs peuvent être utilisés pour mesurer les taux de synthèse du CoA dans les cellules. Les méthodes actuelles de mesure des dérivés du CoA et du CoA dans les échantillons biologiques ont été examinées22 et comprennent des essais spectrophotométriques enzymatiques couplés, une chromatographie liquide à haute pression et des procédures basées sur la spectrométrie de masse. Cependant, ces méthodes sont souvent axées sur des espèces moléculaires de CoA particulières et sont aveugles à la variation du pool total de CoA. Les essais enzymatiques couplés nécessitent généralement de plus grandes quantités de matériel d’entrée en raison de sensibilités de détection faibles et ont une gamme limitée de linéarité.
Notre laboratoire a développé une procédure fiable pour la quantification du Total des ACo dans les cellules cultivées et les tissus animaux. La stratégie comprend l’hydrolyse de tous les thioesters CoA pour ne produire que des ACo gratuits pendant la préparation de l’échantillon, plutôt que de faire des efforts pour maintenir et analyser l’ensemble du spectre des espèces de CoA. La procédure est une compilation de méthodes individuelles publiées pour la préparation de l’échantillon, la dérivation du CDA, la purification et l’identification après chromatographie liquide à haute pression (HPLC), et la quantification du CDA dérivé par absorption ou détection de fluorescence23,24,25. Les déterminations de la CDA obtenues à l’aide de cette procédure ont permis de comprendre la réglementation de la CDA et de développer une approche thérapeutique pour le traitement des carences en CaD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons une procédure fiable, étape par étape pour quantifier le Total CoA dans les cellules et les tissus animaux avec un large éventail de détection linéaire qui est accessible dans de nombreux laboratoires qui ont un HPLC avec soit un détecteur de sortie d’absorption ou de fluorescence. Alternativement, la spectrométrie de masse est une technique courante pour évaluer les thioesters CoA et CoA, mais n’est pas largement disponible en raison du coût de l’instrumentation et des connaissances spéc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le financement de la recherche parrainée fournie par CoA Therapeutics, Inc., une filiale de BridgeBio LLC, les National Institutes of Health subvention GM34496, et l’American Lebanese Syrian Associated Charities.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
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