細胞および組織におけるコエンザイムAの定量
Summary
この方法は、培養細胞および動物組織からのサンプル調製、試料中のコエンザイムAの抽出および誘導体化、続いて誘導体化されたコエンザイムAの精製および定量のための高圧液体クロマトグラフィーを記載する。吸光度または蛍光検出。
Abstract
新しい研究は、細胞補酵素A(CoA)供給が成長、代謝および生存に有害な影響で制限されることができることを明らかにしました。細胞CoAの測定は、その比較的低い存在量と、順番に、多数の代謝反応に関与するCoAチオエステルへの自由CoAの動的変換による課題です。サンプル調製中に潜在的な落とし穴をナビゲートし、多くの生物医学研究室での使用に適した幅広い線形検出でアッセイを得る方法が記載されています。
Introduction
コエンザイムA(CoA)は、すべての生物に不可欠な共因子であり、パントテン酸(パントテン酸の塩)またはビタミンB5とも呼ばれるパントテン酸から合成されます。CoAは、酢酸やコハク酸などの短鎖酸を含む有機酸の主要な細胞内担体であり、プロピオン酸やメチルマロン酸などの分岐鎖酸、パルミテートやオレエートなどの長鎖脂肪酸、非常に長鎖脂肪酸等多価不飽和脂肪酸、及びバルプロ酸などの異生物製剤。有機酸は、中間代謝1における100以上の反応における基質としての使用を可能にするために、CoAと酵素的にチオスターリンケージを形成する。CoAチオエステルはまた、アロステリックレギュレータおよび転写活性化剤である。細胞全体のCoA供給が3、4を規制されていることは今では2を評価されています。したがって、CoAの利用可能性は制限され、CoAの欠乏は、CoA生合成5に影響を与える遺伝的障害によって例示されるように、壊滅的なことができます。パントテナテキナーゼは、CoA生合成(図1)およびパントテナテキナーゼ関連神経変性、PKANと呼ばれる、PANK2遺伝子6の突然変異によって引き起こされる第一歩を触媒する。COASYN遺伝子によってコードされるCoA合成酵素は、CoA生合成(図1)およびCOASYタンパク質関連神経変性(CoPAN)の最後の2つのステップを触媒し、COASYN遺伝子7の突然変異によって引き起こされる。PKANとCoPANの両方は、脳内の鉄蓄積に関連する神経変性疾患とCoA欠乏症の下で疾患病理の下に継承されています。
全CoAの細胞レベルは組織8によって異なり、全CoAは様々な生理学的、病理学的および薬理学的状態の下で増加または減少することができる。肝臓CoAは、給餌状態から断食状態9への燃料切り替え中に増加し、レプチン欠損肥満マウス10では肝臓CoAレベルが異常に高い。肝臓CoAは、慢性エタノール摂取に応答して減少する 11.Pank2ノックアウトマウスモデルにおける脳CoAレベルは周産期中にうつ病化されるが、成人期の後の脳CoA含有量は野生型レベルと同等であり、開発12の間に適応的CoA応答を示す。トランスジェネシスまたは遺伝子送達法による組織CoA含有量の操作は、代謝および神経機能に影響を与える13,14,15.PKANまたはCoPANのための潜在的な治療法の前臨床開発は、有効性の指標として細胞または組織CoA測定を含む16,17,18,19,20.これらすべての条件とその代謝または機能的結果の評価には、CoA全体の測定のための定量的方法が必要です。
生物学的サンプル中のCoAを測定するための正確で信頼性の高いアッセイは、多くのラボで技術的な課題です。残念ながら、無傷の細胞におけるCoAまたはCoAチオエステルを評価または定量化するためのプローブはないが、天然CoAチオエステルの類似体は、酵素21を利用したCoAエステルの研究において機械的プローブとして広く用いられている。CoAの変換は、遊離スルフヒドリル(-SH)部分を用いて、CoAチオエステル(またはその逆)に対して、異なる環境への転移中および細胞リシス中に細胞または動物組織において急速である。多数のアシルCoA合成酵素およびアシル-CoAチオエステラーゼは、CoAプール内の相互変換を仲介し、CoAチオエステルを基質として利用する追加の酵素は、化学的または物理的に消毒されるまで生物学的サンプルにおいて活性を維持する。手段。アシルトランスフェラーゼによるCoAからカルニチンへのアシル基のオフロードは、CoA/CoAチオエステル分布を変化させることができる反応のネットワーク内の一例です。放射性トレーサーは、細胞内のCoA合成率を測定するために使用することができます。生体試料中のCoAおよびCoA誘導体を測定するための現在の方法は22を検討され、結合酵素分光光アッセイ、高圧液体クロマトグラフィーおよび質量分析ベースの手順が含まれる。しかし、これらの方法は、多くの場合、特定のCoA分子種に焦点を当てており、全CoAプールの変動に盲目である。結合された酵素アッセイは、一般に、検出感度が低いため、より大量の入力材料を必要とし、線形性の範囲が限られています。
当研究室では、培養細胞および動物組織におけるCoA全体の定量化に関する信頼性の高い手順を開発しました。この戦略には、CoA種のスペクトル全体を維持および分析する努力をするのではなく、サンプル調製中に無料のCoAのみを得るために、すべてのCoAチオエステルの加水分解が含まれます。この手順は、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)に続くサンプル調製、CoA誘導体化、精製および同定、および吸収性による導出CoAの定量化のための個々の公開方法をまとめたものである。蛍光検出23,24,25.この手順を用いて得られたCoAの決定は、CoA規則の理解とCoA欠陥の治療のための治療アプローチの開発を可能にしました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、吸光度または蛍光出力検出器を備えたHPLCを持つ多くのラボでアクセス可能な幅広い線形検出を持つ細胞および動物組織の全CoAを定量するための信頼性の高いステップバイステップの手順を示します。あるいは、質量分析はCoAおよびCoAチオエステルを評価するための一般的な技術であるが、計測器のコストとデータの方法論および解釈の開発に必要な専門知識のために広く利用でき…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、BridgeBio LLCの子会社であるCoAセラピューティクス社、国立衛生研究所補助金GM34496、およびアメリカのレバノン・シリア関連慈善団体が提供する研究に対する資金提供を認めている。
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
Riferimenti
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