Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Summary

Este método descreve a preparação da amostra de células cultivadas e tecidos animais, extração e derivatização da coenzima A nas amostras, seguida de cromatografia líquida de alta pressão para purificação e quantificação da coenzima a derivatizada por absorvância ou detecção de fluorescência.

Abstract

A pesquisa emergente revelou que a fonte celular da coenzima A (CoA) pode tornar-se limitando com um impacto prejudicial no crescimento, no metabolismo e na sobrevivência. A medida do COA celular é um desafio devido a sua abundância relativamente baixa e à conversão dinâmica de COA livre aos tioésteres de COA que, por sua vez, participam em reações metabólicas numerosas. Um método é descrito que navega através das armadilhas potenciais durante a preparação da amostra para render um ensaio com uma escala linear larga da deteção que seja apropriada para o uso em muitos laboratórios biomédicos.

Introduction

Coenzima A (COA) é um cofator essencial em todos os organismos vivos e é sintetizada a partir de ácido pantotênico, também chamado pantotenato (o sal do ácido pantotênico) ou vitamina B5. O CoA é o principal portador intracelular de ácidos orgânicos, incluindo ácidos de cadeia curta, como acetato e succinato, ácidos de cadeia ramificada, como propionato e metilmalonato, ácidos graxos de cadeia longa, como palmitato e oleato, ácidos graxos de cadeia muito longa, como ácidos graxos poliinsaturados e xenobióticos, como o ácido valproico. O ácido orgânico dá forma a um enlace do Tioéster enzymaticamente com o COA para permitir seu uso como um substrato em mais de 100 reações no metabolismo intermediário¹. Os tioésteres de COA são também reguladores alostérico e activators transcricional. É apreciado agora² que a fonte total celular do COA é regulada^3,4; assim, a disponibilidade de CoA pode ser limitante, e que as deficiências de CoA podem ser catastróficas, como exemplificada por desordens genéticas herdadas que impactam o biossynthesis⁵do COA. A quinase de pantothenate catalisa a primeira etapa na biossíntese de CoA (Figura 1) e a neurodegeneração associada Pantothenate da quinase, chamada pkan, é causada por mutações no gene PANK2 ⁶. A enzima CoA sintase, codificada pelo gene Coasyn , catalisa os dois últimos passos na biossíntese de COA (Figura 1) e a neurodegeneração associada à proteína Coasy, denominada Copan, é causada por uma mutação no gene da coasyn ⁷. Ambos pkan e Copan são doenças neurodegenerativas herdadas associadas com a acumulação do ferro nas deficiências do cérebro e do COA Underly as patologias da doença.

Os níveis celulares do CoA total variam entre os tecidos⁸ e o COA total pode aumentar ou diminuir uma variedade de Estados fisiológicos, patológicos e farmacológicos. O CoA do fígado aumenta durante o switching do combustível do FED ao estado jejuado⁹, e os níveis do COA do fígado são anormalmente elevados em ratos obesos leptin-deficientes¹⁰. O CoA do fígado diminui em resposta à ingestão crônica do etanol¹¹. Os níveis do CoA do cérebro no modelo do rato do Knockout Pank2 são deprimidos durante o período perinatal, mas mais tarde no índice adulto do COA do cérebro do estágio são equivalentes aos níveis do selvagem-tipo, indicando uma resposta adaptativa do COA durante o desenvolvimento¹². A manipulação do conteúdo de COA tecidual por métodos de transgênese ou de entrega gênica impacta as funções metabólicas e neurais^13,14,15. O desenvolvimento pré-clínico de terapias potenciais para pkan ou Copan inclui medidas da célula ou do tecido COA como indicadores da eficácia^{16,17,18,19,20} . A avaliação de todas estas condições e suas conseqüências metabólicas ou funcionais exige um método quantitativo para a medida do CoA total.

Um ensaio preciso e fiável para a medição de CoA em amostras biológicas é um desafio técnico em muitos laboratórios. Infelizmente, não há sondas disponíveis para avaliar ou quantificar tioésteres de COA ou CoA em células intactas, embora os análogos de tioésteres de CoA natural tenham sido amplamente utilizados como sondas mecanísticas em estudos de éster CoA utilizando enzimas²¹. A conversão do COA, com uma fração livre do sulfidrila (-SH), a um Tioéster de COA (ou reciprocamente) é rápida nas pilhas ou nos tecidos animais durante a transferência a um ambiente diferente e durante o lysis da pilha. Numerosas sinthetases de acilo-CoA e tioesterases de acilo-CoA nas células mediam as interconversões dentro da piscina CoA, e enzimas adicionais que utilizam tioésteres de CoA como substratos permanecem ativas em amostras biológicas até serem extinto por substâncias químicas ou físicas Significa. O off-loading de Acyl-grupos do COA à carnitina por Acyl-transferases é um exemplo dentro da rede das reações que podem alterar a distribuição do Tioéster de COA/COA. Os traçadores radioativos podem ser usados para medir as taxas de síntese de CoA nas células. Os métodos atuais para a medição de derivados de CoA e CoA em amostras biológicas foram revisados²² e incluem ensaios espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografia líquida de alta pressão e procedimentos baseados em espectrometria de massas. Entretanto, estes métodos são centrados frequentemente em espécies moleculars específicas do CoA e são cegos à variação da associação total do CoA. Os ensaios enzimáticos acoplados geralmente exigem maiores quantidades de material de entrada devido a baixas sensibilidades de detecção e têm uma faixa limitada de linearidade.

Nosso laboratório desenvolveu um procedimento de confiança para a quantificação do CoA total em pilhas cultivadas e em tecidos animais. A estratégia inclui a hidrólise de todos os tioésteres de COA para render somente o COA livre durante a preparação da amostra, um pouco do que fazendo esforços para manter e analisar o espectro inteiro de espécies de COA. O procedimento é uma compilação de métodos publicados individuais para a preparação da amostra, a derivação do COA, a purificação e a identificação depois da cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), e a quantificação do COA derivatizado pela absorvência ou detecção de fluorescência^23,24,25. As determinações do CoA obtidas usando este procedimento permitiram nossa compreensão da regulação do CoA e o desenvolvimento de uma aproximação terapêutica para o tratamento de deficiências de CoA.

Protocol

O procedimento animal referido neste protocolo foi realizado de acordo com os protocolos 323 e 556 e especificamente aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais do hospital de pesquisa infantil St. Jude. 1. preparação de soluções Nota: Use água ultrapura para todas as soluções e quando indicado nos procedimentos. Prepare 1 mM de hidróxido de potássio (KOH) em água. Prepare 0,25 M KOH na água. Prepare 1 M…

Representative Results

Um método relativamente rápido e de confiança para a deteção do COA total em pilhas e em tecidos cultivados foi desenvolvido derivatização o tiol do COA a um agente fluorescente usando o mbbr, e então purificante o COA-bimane derivatizado usando a HPLC da fase reversa. Uma curva padrão é gerada pela primeira vez, onde as quantidades conhecidas e crescentes da norma CoA-bimana são injetadas individualmente e as áreas os picos dos cromatogramas CoA-bimane são plotadas em função da entrada CoA-bimana (<strong…

Discussion

Aqui nós demonstramos um procedimento de confiança, passo a passo para quantificar o CoA total nas pilhas e nos tecidos animais com uma escala larga da deteção linear que seja acessível em muitos laboratórios que têm um HPLC com uma absorvência ou um detector da saída da fluorescência. Alternativamente, a espectrometria de massas é uma técnica comum para a avaliação de tioésteres de CoA e CoA, mas não está amplamente disponível devido ao custo da instrumentação e ao conhecimento especializado exigido …

Materials

2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column	Millipore-Sigma	54127-U
coenzyme A	Avanti Polar Lipids	870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column	Phenomenex	00F-4439-E0
monobromobimane	ThermoFisher Scientific	M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter	Omni International	32750H
Parafilm	Fisher	S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer	ThermoFisher Scientific	NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter	CoStar	8161
Trizma-HCl	Fisher	T395-1
Waters 2475 fluorescence detector	Waters	2475
Waters 2489 UV-Vis detector	Waters	2489
Waters e2695 separations module	Waters	e2695