Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels
Summary
Deze methode beschrijft de monstervoorbereiding uit gekweekte cellen en dierlijk weefsel, extractie en derivatisering van coenzym A in de monsters, gevolgd door hogedrukvloeistofchromatografie voor zuivering en kwantificering van het guarderivaten coenzym a door absorptie of fluorescentiedetectie.
Abstract
Opkomende onderzoek is gebleken dat het cellulaire co-enzym A (CoA) levering kan worden beperkt met een nadelig effect op de groei, metabolisme en overleving. Meting van cellulaire CoA is een uitdaging vanwege de relatief lage overvloed en de dynamische omzetting van gratis CoA naar CoA thioesters die, op zijn beurt, deelnemen aan talrijke metabole reacties. Een methode wordt beschreven die tijdens de monstervoorbereiding door potentiële valkuilen navigeert om een assay te leveren met een breed lineair detectiebereik dat geschikt is voor gebruik in vele biomedische laboratoria.
Introduction
Co-enzym A (CoA) is een essentiële cofactor in alle levende organismen en wordt gesynthetiseerd uit pantotheenzuur, ook wel pantothenaat (het zout van pantotheenzuur) of vitamine B5. CoA is de belangrijkste intracellulaire drager van organische zuren, met inbegrip van korte-keten-zuren zoals acetaat en succinaat, tak-keten zuren zoals propionaat en methylmalonaat, lange-keten vetzuren zoals palmitaat en OLEAAT, zeer lange-keten vetzuren zoals meervoudig onverzadigde vetzuren en xenobiotica zoals valproïnezuur. Het organisch zuur vormt een thio ester binding enzymatisch met CoA om het gebruik ervan als substraat in meer dan 100 reacties in intermediair metabolisme1mogelijk te maken. CoA thioesters zijn ook allosterische regelgevers en transcriptionele activatoren. Het wordt nu gewaardeerd2 dat de cellulaire totale COA-levering is gereguleerd3,4; de beschikbaarheid van CoA kan dus worden beperkt en dat CoA-tekortkomingen catastrofaal kunnen zijn, zoals blijkt uit erfelijke genetische aandoeningen die van invloed zijn op CoA-biosynthese5. Pantothenate kinase katalyseert de eerste stap in CoA biosynthese (Figuur 1) en pantothenaat kinase geassocieerde neurodegeneratie, genaamd pkan, wordt veroorzaakt door mutaties in het PANK2 gen6. CoA-synthase, gecodeerd door het Coasyn -gen, katalyseert de laatste twee stappen in COA-biosynthese (Figuur 1) en Coasy eiwit-geassocieerde neurodegeneratie, genaamd Copan, wordt veroorzaakt door een mutatie in het coasyn Gene7. Zowel PKAN als CoPAN zijn erfelijke neurodegeneratieve ziekten geassocieerd met ijzer ophoping in de hersenen en CoA-tekortkomingen ten ondermeer de pathologieën van de ziekte.
Cellulaire niveaus van totaal CoA variëren tussen de weefsels8 en het totale COA kan verhogen of verlagen onder een verscheidenheid van fysiologische, pathologische en farmacologische toestanden. Lever CoA stijgt tijdens brandstof overschakelen van de Fed naar de nuchtere staat9, en lever COA niveaus zijn abnormaal hoog in leptine-deficiënte zwaarlijvige muizen10. Lever CoA afneemt in reactie op chronische ethanol inname11. Hersenen CoA-niveaus in de Pank2 Knockout muismodel zijn depressief tijdens de perinatale periode, maar later in de volwassen fase hersenen COA-inhoud is gelijkwaardig aan wild-type niveaus, wat duidt op een adaptieve COA reactie tijdens ontwikkeling12. Manipulatie van weefsel-COA-inhoud door Transgenese of genafgifte methoden beïnvloedt metabole en neurale functies13,14,15. De preklinische ontwikkeling van mogelijke therapieën voor pkan of Copan omvat de COA-metingen van cellen of weefsels als indicatoren voor de werkzaamheid16,17,18,19,20 . Evaluatie van al deze voorwaarden en hun metabole of functionele gevolgen vereist een kwantitatieve methode voor het meten van het totale CoA.
Een nauwkeurige, betrouwbare assay voor het meten van CoA in biologische monsters is een technische uitdaging in veel laboratoria. Helaas zijn er geen sondes beschikbaar om CoA-of CoA-thioesters in intacte cellen te evalueren of te kwantificeren, hoewel analogen van natuurlijke CoA-thioesters op grote schaal zijn gebruikt als mechanistische sondes in studies van CoA-ester met behulp van enzymen21. De omzetting van CoA, met een vrije sulfhydrylgroep (-sh) groep, naar een CoA thio ester (of omgekeerd) is snel in cellen of dierlijk weefsel tijdens overdracht naar een andere omgeving en tijdens cel lysis. Talrijke acyl-CoA-synthetases en acyl-CoA-thioesterasen in cellen bemiddel de interconversies binnen de CoA-groep en aanvullende enzymen die gebruikmaken van CoA thioesters als substraten blijven actief in biologische monsters totdat ze worden geblust door chemische of fysische Betekent. De off-loading van acyl-groepen van CoA naar carnitine door acyl-transferases is een voorbeeld binnen het netwerk van reacties dat de CoA/CoA thio ester distributie kan veranderen. Radioactieve tracers kunnen worden gebruikt om de frequenties van de CoA-synthese in cellen te meten. De huidige methoden voor het meten van CoA-en CoA-derivaten in biologische monsters zijn22 beoordeeld en omvatten gekoppelde enzymatische spectrofotometrische assays, hogedrukvloeistofchromatografie en op massaspectrometrie gebaseerde procedures. Deze methoden zijn echter vaak gericht op specifieke CoA-moleculaire soorten en zijn blind voor variatie van het totale CoA-zwembad. De gekoppelde enzymatische assays vereisen over het algemeen grotere hoeveelheden input materiaal als gevolg van lage detectie gevoeligheden en hebben een beperkt bereik van lineariteit.
Ons laboratorium heeft een betrouwbare procedure ontwikkeld voor de kwantificering van totaal CoA in gekweekte cellen en dierlijke weefsels. De strategie omvat de hydrolyse van alle CoA-thioesters om alleen gratis CoA te leveren tijdens de monstervoorbereiding, in plaats van inspanningen te leveren om het gehele spectrum van CoA-soorten te behouden en te analyseren. De procedure is een compilatie van afzonderlijke gepubliceerde methoden voor monstervoorbereiding, COA-derivatisering, zuivering en identificatie na hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en kwantificering van het guarderivaten CoA door absorptie of fluorescentiedetectie23,24,25. De door deze procedure verkregen CoA-bepalingen hebben ons inzicht in de CoA-regulatie en de ontwikkeling van een therapeutische aanpak voor de behandeling van CoA-tekortkomingen mogelijk gemaakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier tonen we een betrouwbare, stapsgewijze procedure voor het kwantificeren van totaal CoA in cellen en dierlijke weefsels met een breed scala aan lineaire detectie die toegankelijk is in veel laboratoria met een HPLC met een absorptie-of fluorescentie-uitgangs detector. Als alternatief is massaspectrometrie een veelgebruikte techniek voor het evalueren van CoA-en CoA-thioesters, maar is niet algemeen beschikbaar vanwege de kosten van de instrumentatie en de gespecialiseerde kennis die nodig is voor de ontwikkeling van …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de financiering van gesponsord onderzoek dat wordt aangeboden door CoA Therapeutics, Inc., een dochteronderneming van BridgeBio LLC, de National Institutes of Health Grant GM34496, en de Amerikaanse Libanese Syrische geassocieerde liefdadigheidsinstellingen.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
Riferimenti
- Abiko, Y., Greenburg, D. M. . Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4′-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) – Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
