कोशिकाओं और ऊतकों में कोएंजाइम ए का परिमाण
Summary
इस विधि से सुसंस्कृत कोशिकाओं और पशु ऊतकों से नमूना तैयारी का वर्णन करता है, नमूनों में कोएंजाइम ए की निकासी और व्युत्पन्नीकरण, इसके बाद उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के बाद derivatized कोएंजाइम ए के शुद्धिकरण और परिमाणीकरण के लिए अवशोषण या फ्लोरोसेंट का पता लगाने.
Abstract
उभरते अनुसंधान से पता चला है कि सेलुलर कोएंजाइम ए (सीओए) की आपूर्ति विकास, चयापचय और अस्तित्व पर एक हानिकारक प्रभाव के साथ सीमित हो सकता है। सेलुलर CoA के मापन अपनी अपेक्षाकृत कम बहुतायत और CoA thioesters के लिए मुक्त CoA के गतिशील रूपांतरण के कारण एक चुनौती है कि, बारी में, कई चयापचय प्रतिक्रियाओं में भाग लेते हैं. एक विधि है कि नमूना तैयारी के दौरान संभावित नुकसान के माध्यम से नेविगेट पता लगाने की एक व्यापक रैखिक रेंज है कि कई जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए उपयुक्त है के साथ एक परख उपज वर्णन किया है.
Introduction
कोएंजाइम ए (सीओए) सभी जीवित जीवों में एक आवश्यक सहकारक है और पैन्टोथेनिक एसिड से संश्लेषित होता है, जिसे पैन्टोथेनेट (पैन्टोथेनिक एसिड का नमक) या विटामिन बी 5 भी कहा जाता है। CoA कार्बनिक एसिड के प्रमुख intracellular वाहक है, इस तरह के रूप में ऐसी एसीटेट और succinate के रूप में लघु श्रृंखला एसिड, शाखा श्रृंखला एसिड जैसे प्रोपिओनेट और मिथाइलमालोनेट, लंबे समय से चेन फैटी एसिड जैसे पामिटेट और oleate, बहुत लंबी श्रृंखला फैटी एसिड जैसे पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड, और वैल्प्रोइक एसिड जैसे विदेशी जीव. ऑर्गेनिक एसिड एक थायोस्टर लिंकेज का रूप ले सकता है जो कोए के साथ है ताकि इसके उपयोग को मध्यवर्ती चयापचय1में 100 से अधिक प्रतिक्रियाओं में एक सब्सट्रेट के रूप में सक्षम बनाया जा सके . कोए थायोएस्टर्स भी एलोस्टेरिक नियामकों और ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक हैं। अब यह2 की सराहना की है कि सेलुलर कुल सीओए आपूर्ति विनियमित है3,4; इस प्रकार, CoA उपलब्धता सीमित किया जा सकता है, और है कि CoA की कमी भयावह हो सकता है, के रूप में विरासत में मिला आनुवंशिक विकारों है कि CoA biosynthesisप्रभाव सेउदाहरण 5 . Pantothenate kinase कोए बायोसिंथेसिस में पहला कदम उत्प्रेरित करता है (चित्र 1) और पैन्टोथेनेट किनेस एसोसिएटेड न्यूरोडिजेनरेशन, जिसे PKAN कहा जाता है, PANK2 जीन6में उत्परिवर्तन के कारण होता है । COA synthase, COASYN जीन द्वारा इनकोडिंग, CoAbiosynthesis में अंतिम दो चरणों को उत्प्रेरित करता है (चित्र 1) और COASY प्रोटीन-एसोसिएटेड न्यूरोडेजेनरेशन, CoPAN कहा जाता है, COASYN जीन में एक उत्परिवर्तन के कारण होता है7. दोनों PKAN और CoPAN मस्तिष्क में लोहे के संचय के साथ जुड़े neurodegenerative रोगों विरासत में मिला है और CoA कम से कम रोग रोगों की कमी.
कुल CoA के सेलुलर स्तर ऊतकों के बीच भिन्न8 और कुल CoA वृद्धि या शारीरिक, रोग और औषधीय राज्यों की एक किस्म के तहत कम कर सकते हैं. लिवर CoA तेजी से राज्य9के लिए खिलाया से ईंधन स्विचन के दौरान बढ़ जाती है , और जिगर CoA स्तर असामान्य रूप से लेप्टिन की कमी मोटापे से ग्रस्त चूहों10में उच्च रहे हैं . जिगर CoA पुरानी इथेनॉल घूस11के जवाब में कम हो जाती है. Pank2 नॉकआउट माउस मॉडल में मस्तिष्क CoA स्तर प्रसव अवधि के दौरान उदास कर रहे हैं, लेकिन बाद में वयस्क चरण मस्तिष्क CoA सामग्री में जंगली प्रकार के स्तर के बराबर है, विकास के दौरान एक अनुकूली CoA प्रतिक्रिया का संकेत12. ट्रांसजेनेसिस या जीन वितरण विधियों द्वारा ऊतक कोए सामग्री का हेरफेर चयापचय और तंत्रिका कार्यों को प्रभावित करता है13,14,15. PKAN या CoPAN के लिए संभावित चिकित्सा के पूर्व नैदानिक विकास सेल या ऊतक CoA माप प्रभावकारिता के संकेतक के रूप में शामिल16,17,18,19,20 . इन शर्तों और उनके चयापचय या कार्यात्मक परिणामों के सभी का मूल्यांकन कुल CoA की माप के लिए एक मात्रात्मक विधि की आवश्यकता है.
जैविक नमूनों में CoA को मापने के लिए एक सटीक, विश्वसनीय परख कई प्रयोगशालाओं में एक तकनीकी चुनौती है. दुर्भाग्य से, वहाँ कोई जांच का मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध हैं या बरकरार कोशिकाओं में CoA या CoA thioesters मात्रा, हालांकि प्राकृतिक CoA thioesters के एनालॉग व्यापक रूप से एंजाइमों का उपयोग करने के लिए CoA एस्टर के अध्ययन में मशीनी जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया है21. CoA के रूपांतरण, एक मुक्त sulfhydryl के साथ (-SH) moiety, एक CoA thioester के लिए (या इसके विपरीत) कोशिकाओं या पशु ऊतकों में एक अलग वातावरण में स्थानांतरण के दौरान और सेल lysis के दौरान तेजी से है. कोशिकाओं में कई ऐसिल-कोए सिंथेटासेस और ऐसिल-कोए थायोएस्टेरेज़ को कोए पूल के भीतर अंतर-परिवर्तन ों को मध्यस्थता करते हैं, और अतिरिक्त एंजाइम जो कोए थायोएस्टर ्स्वेश के रूप में काउपयोग करते हैं, जैविक नमूनों में सक्रिय रहते हैं जब तक कि रासायनिक या भौतिक द्वारा मशांत न हो। मतलब. Acyl-transferases द्वारा carnitine करने के लिए CoA से acyl-समूहों की ऑफ लोडिंग प्रतिक्रियाओं के नेटवर्क के भीतर एक उदाहरण है कि CoA/CoA थायोएस्टर वितरण को बदल सकते हैं. रेडियोधर्मी अनुरेखक कोशिकाओं में CoA संश्लेषण की दरों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जैविक नमूनों में CoA और CoA डेरिवेटिव को मापने के लिए वर्तमान तरीकों की समीक्षा की गई है22 और युग्मित enzymatic स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक assays, उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रक्रियाओं में शामिल हैं. हालांकि, इन तरीकों अक्सर विशेष CoA आणविक प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं और कुल CoA पूल की भिन्नता के लिए अंधा कर रहे हैं. युग्मित एंजाइमी परख आम तौर पर कम पता लगाने संवेदनशीलता के कारण इनपुट सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है और रैखिकता की एक सीमित रेंज है.
हमारी प्रयोगशाला सुसंस्कृत कोशिकाओं और पशु ऊतकों में कुल सीओए के परिमाणीकरण के लिए एक विश्वसनीय प्रक्रिया विकसित की है. रणनीति सभी CoA thioesters के hydrolysis नमूना तैयारी के दौरान केवल मुक्त CoA उपज शामिल है, बजाय बनाए रखने और CoA प्रजातियों के पूरे स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करने के प्रयास करने से. प्रक्रिया नमूना तैयारी के लिए व्यक्तिगत प्रकाशित तरीकों का एक संकलन है, CoA derivatization, शुद्धि और उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के बाद पहचान (HPLC), और अवशोषण द्वारा derivatized CoA की मात्रा या प्रतिदीप् ति का पता लगाने23,24,25. CoA इस प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त दृढ़ संकल्प CoA विनियमन और CoA की कमी के उपचार के लिए एक चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास की हमारी समझ सक्षम है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम रैखिक का पता लगाने की एक विस्तृत श्रृंखला है कि या तो एक अवशोषण या फ्लोरोसेंट उत्पादन डिटेक्टर के साथ एक HPLC है में पहुँचा जा सकता है की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ कोशिकाओं और पशु ऊतकों में कुल CoA म?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों CoA चिकित्सा, इंक, BridgeBio LLC, स्वास्थ्य अनुदान GM34496 के राष्ट्रीय संस्थानों, और अमेरिकी लेबनान सीरियाई एसोसिएटेड दान की एक सहायक द्वारा प्रदान की प्रायोजित अनुसंधान के लिए धन स्वीकार करते हैं.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
Riferimenti
- Abiko, Y., Greenburg, D. M. . Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4′-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) – Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
