Kvantifisering av koenzym A i celler og vev

Summary

Denne metoden beskriver prøven forberedelse fra kultivert celler og animalsk vev, ekstraksjon og derivatization av koenzym A i prøvene, etterfulgt av høytrykks væske kromatografi for rensing og kvantifisering av derivatized koenzym A ved absorbansen eller fluorescens deteksjon.

Abstract

Emerging forskning har avdekket at mobilnettet koenzym A (CoA) forsyning kan bli begrensende med en ødeleggende innvirkning på vekst, metabolisme og overlevelse. Måler av Cellular CoA er en angripe på grunn av dens relativt lav overflod og det drivkraft omdanne av ledig CoA å CoA thioesters det, etter tur, delta inne tallrik metabolic reaksjonene. En metode er beskrevet som navigerer gjennom potensielle fallgruver under prøven forberedelse til å gi en analyse med et bredt lineær utvalg av deteksjon som er egnet for bruk i mange biomedisinsk laboratorier.

Introduction

Koenzym A (CoA) er en essensiell kofaktor i alle levende organismer og er syntetisert fra Pantotensyre syre, også kalt pantothenate (salt av Pantotensyre syre) eller vitamin B5. CoA er den store intracellulære bærer av organiske syrer, inkludert kort-kjeden syrer som acetate og succinate, gren-kjeden syrer som propionate og methylmalonate, lang-kjeden fettsyrer som askorbylpalmitat og oleat, veldig lang kjede fettsyrer som flerumettede fettsyrer, og xenobiotics som Valproic syre. Den organiske syre danner en thioester sammenheng enzymatisk med CoA å muliggjøre bruken som et substrat i over 100 reaksjoner i mellomledd metabolisme¹. CoA thioesters er også nukleosid regulatorer og transcriptional aktivator. Det er nå verdsatt² at mobilnettet totale COA Supply er regulert^3,4; Derfor kan CoA-tilgjengelighet begrenses, og at CoA-mangler kan være katastrofale, som et eksempel på arvet genetiske lidelser som påvirker CoA-biosyntesen⁵. Pantothenate kinase katalyserer det første trinnet i CoA-biosyntesen (figur 1) og pantothenate kinase Associated neurodegeneration, kalt PKAN, er forårsaket av mutasjoner i PANK2 Gene⁶. CoA-syntase, som er kodet av COASYN -genet, katalyserer de to siste trinnene i COA-biosyntesen (figur 1) og COASY-assosiert neurodegeneration, kalt CoPAN, forårsakes av en mutasjon i COASYN -genet⁷. Både PKAN og CoPAN er arvet nevrodegenerative sykdommer forbundet med jern akkumulering i hjernen og CoA mangler underliggende sykdommen patologi.

Cellulære nivåer av total CoA varierer mellom vev⁸ og total COA kan øke eller redusere under en rekke fysiologiske, patologiske og farmakologiske tilstander. Leveren CoA øker under drivstoff skifter fra matet til fastende stat⁹, og leveren COA nivåer er unormalt høy i leptin-mangelfull overvektige mus¹⁰. Liver CoA avtar som følge av kronisk etanol inntak¹¹. Brain CoA nivåer i Pank2 knockout muse modellen er deprimert i løpet av Perinatal perioden, men senere i den voksne scenen hjernen COA innhold tilsvarer Wild-type nivåer, noe som indikerer en adaptiv COA respons under utbygging¹². Manipulering av vev COA innhold ved transgenesis eller gen leveringsmetoder virkninger metabolske og nevrale funksjoner^13,14,15. Prekliniske utvikling av potensielle terapi for PKAN eller CoPAN inkluderer celle eller vev COA målinger som indikatorer for effekt^{16,17,18,19,20} . Evaluering av alle disse forholdene og deres metabolske eller funksjonelle konsekvenser krever en kvantitativ metode for måling av total CoA.

En nøyaktig, pålitelig analysen for måling av CoA i biologiske prøver er en teknisk utfordring i mange laboratorier. Beklageligvis, der er nei sonder anvendelig å vurdere eller kvantifisere CoA eller CoA thioesters inne Behold celler, til tross for analogs av naturlig CoA thioesters ha blitt vidt anvendt idet mekanistisk sonder inne studier av CoA Ester bruker enzym²¹. Konverteringen av CoA, med en gratis sulfhydrylgruppen (-SH) moiety, til en CoA thioester (eller vice versa) er rask i celler eller animalsk vev under overføring til et annet miljø og under cellelyse. Tallrike acyl-CoA-synthetases og acyl-CoA-thioesterases i cellene megle i interconversions i ekthetsgarantien, og ytterligere enzymer som utnytter CoA-thioesters som underlag, forblir aktive i biologiske prøver til slukket av kjemiske eller fysiske Betyr. Off-lasting av acyl-grupper fra CoA til carnitine av acyl-transferases er ett eksempel innenfor nettverket av reaksjoner som kan endre CoA/CoA thioester fordelingen. Radioaktive Bevegelsesuskarphet kan brukes til å måle frekvensen av CoA syntese i celler. Gjeldende metoder for måling av CoA-og CoA-derivater i biologiske prøver har gjennomgått²² og inkluderer sammenkoblede enzymatisk Spektrofotometriske analyser, høytrykks væske kromatografi og masse massespektrometri prosedyrer. Men disse metodene er ofte fokusert på bestemte CoA molekyl arter og er blinde for variasjon av det totale CoA bassenget. De sammenkoblede enzymatisk analysene krever vanligvis større mengder inngangs materiale på grunn av lav deteksjons følsomhet og har et begrenset utvalg av linearitet.

Vårt laboratorium har utviklet en pålitelig prosedyre for kvantifisering av total CoA i kulturperler celler og animalsk vev. Strategien omfatter hydrolyse av alle CoA-thioesters for å gi bare gratis CoA under prøve forberedelser, i stedet for å gjøre arbeidet med å vedlikeholde og analysere hele spekteret av CoA-arter. Fremgangsmåten er en samling av individuelle, publiserte metoder for prøveklargjøring, CoA-derivatization, rensing og identifisering etter høytrykks kromatografi (HPLC), og kvantifisering av derivatized CoA ved absorbansen eller fluorescens Detection^23,24,25. The CoA bestemmelser innhentet ved hjelp av denne prosedyren har aktivert vår forståelse av CoA regulering og utvikling av en terapeutisk tilnærming for behandling av CoA mangler.

Protocol

Dyret prosedyren referert til i denne protokollen ble utført i henhold til protokoller 323 og 556 og spesielt godkjent av St. Jude Children ‘ s Research Hospital institusjonelle Animal Care og use Committee. 1. utarbeidelse av løsninger Merk: Bruk ultrarent vann for alle løsninger og når det fremgår av prosedyrene. Forbered 1 mM kalium (KOH) i vann. Forbered 0,25 M KOH i vann. Forbered 1 M Trizma-HCl i vann og Juster til pH 8,0.</l…

Representative Results

En relativt rask og pålitelig metode for påvisning av total CoA i kulturperler celler og vev har blitt utviklet av derivatizing tiolderivat av CoA til et fluorescerende middel ved hjelp mBBr, og deretter rense derivatized CoA-bimane bruker reverse fase HPLC. En standard kurve genereres først, der kjente og økende mengder av CoA-bimane-standarden injiseres individuelt, og områdene under toppene i CoA-bimane-kromatogrammene tegnes som en funksjon av inngangen CoA-bimane (Figur 4). CoA-bim…

Discussion

Her viser vi en pålitelig, trinnvis fremgangsmåte for kvantifisere totale CoA i celler og animalsk vev med et bredt spekter av lineær deteksjon som er tilgjengelig i mange laboratorier som har en HPLC med enten en absorbansen eller fluorescens output detektor. Alternativt, masse massespektrometri er en vanlig teknikk for å evaluere CoA og CoA thioesters, men er ikke allment tilgjengelig på grunn av kostnaden av instrumentering og den spesialiserte kunnskapen som kreves for utvikling av metodikk og tolkning av data. …

Materials

2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column	Millipore-Sigma	54127-U
coenzyme A	Avanti Polar Lipids	870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column	Phenomenex	00F-4439-E0
monobromobimane	ThermoFisher Scientific	M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter	Omni International	32750H
Parafilm	Fisher	S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer	ThermoFisher Scientific	NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter	CoStar	8161
Trizma-HCl	Fisher	T395-1
Waters 2475 fluorescence detector	Waters	2475
Waters 2489 UV-Vis detector	Waters	2489
Waters e2695 separations module	Waters	e2695