Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos
Summary
Este método describe la preparación de muestras a partir de células cultivadas y tejidos animales, extracción y derivación de la coenzima A en las muestras, seguida de cromatografía líquida de alta presión para la purificación y cuantificación de la coenzima A derivada por detección de absorbancia o fluorescencia.
Abstract
Investigaciones emergentes han revelado que el suministro de coenzima celular A (CoA) puede llegar a ser limitante con un impacto perjudicial en el crecimiento, metabolismo y supervivencia. La medición del CoA celular es un desafío debido a su relativamente baja abundancia y la conversión dinámica de coa libre a tioestés de CoA que, a su vez, participan en numerosas reacciones metabólicas. Se describe un método que navega a través de posibles escollos durante la preparación de la muestra para producir un ensayo con una amplia gama lineal de detección que es adecuado para su uso en muchos laboratorios biomédicos.
Introduction
La coenzima A (CoA) es un cofactor esencial en todos los organismos vivos y se sintetiza a partir del ácido pantoténico, también llamado pantotenato (la sal de ácido pantoténico) o vitamina B5. El CoA es el principal portador intracelular de ácidos orgánicos, incluyendo ácidos de cadena corta como acetato y succinato, ácidos de cadena ramificada como propionato y metilmalnato, ácidos grasos de cadena larga como palmitato y oleato, ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos poliinsaturados, y xenobióticos como el ácido valproico. El ácido orgánico forma un enlace tioésico enzimáticamente con CoA para permitir su uso como sustrato en más de 100 reacciones en el metabolismo intermediario1. Los tióreros de CoA también son reguladores alostéricos y activadores transcripcionales. Ahora se aprecia2 que el suministro de CoA total celular está regulado3,4; por lo tanto, la disponibilidad de CoA puede ser limitante, y que las deficiencias de CoA pueden ser catastróficas, como lo ejemplifican los trastornos genéticos hereditarios que afectan la biosíntesis de CoA5. La pantotenato quinasa cataliza el primer paso de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Pantotenato Kinasa, llamada PKAN, es causada por mutaciones en el gen PANK2 6. La coA sintasa, codificada por el gen COASYN, cataliza los dos últimos pasos de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Proteína COASY, llamada CoPAN, es causada por una mutación en el gen COASYN 7. Tanto PKAN como CoPAN son enfermedades neurodegenerativas hereditarias asociadas con la acumulación de hierro en el cerebro y las deficiencias de CoA subyacentes a las patologías de la enfermedad.
Los niveles celulares de CoA total varían entre los tejidos8 y el CoA total puede aumentar o disminuir bajo una variedad de estados fisiológicos, patológicos y farmacológicos. El coA hepático aumenta durante el cambio de combustible de la alimentada al estado de ayuno9, y los niveles de CoA hepático son anormalmente altos en ratones obesos con deficiencia de leptina10. El coA hepático disminuye en respuesta a la ingestión crónica de etanol11. Los niveles de CoA cerebral en el modelo de ratón Nocaut Pank2 están deprimidos durante el período perinatal, pero más tarde en la etapa adulta el contenido de CoA del cerebro es equivalente a los niveles de tipo salvaje, lo que indica una respuesta de CoA adaptable durante el desarrollo12. La manipulación del contenido de coA tisular por transgénesis o métodos de administración de genes afecta a las funciones metabólicas y neuronales13,14,15. El desarrollo preclínico de posibles terapias para PKAN o CoPAN incluye mediciones de CoA celular o tisular como indicadores de eficacia16,17,18,19,20 . La evaluación de todas estas condiciones y sus consecuencias metabólicas o funcionales requiere un método cuantitativo para la medición del CoA total.
Un ensayo preciso y fiable para medir el CoA en muestras biológicas es un desafío técnico en muchos laboratorios. Desafortunadamente, no hay sondas disponibles para evaluar o cuantificar tioesters de CoA o CoA en células intactas, aunque los análogos de los tioesters coA naturales se han utilizado ampliamente como sondas mecanicistas en estudios de éster CoA utilizando enzimas21. La conversión de CoA, con una mitad libre de sulfhidilo (-SH), a un tioester de CoA (o viceversa) es rápida en las células o tejidos animales durante la transferencia a un ambiente diferente y durante la lisis celular. Numerosas acomodatinosas y tilatirasas ayl-CoA en células median las interconversiones dentro de la piscina de CoA, y enzimas adicionales que utilizan tióreros de CoA como sustratos permanecen activos en muestras biológicas hasta que son apagones por sustanciaquímica o física Significa. La descarga de grupos de acil de CoA a carnitina por acil-transferasas es un ejemplo dentro de la red de reacciones que pueden alterar la distribución del tioester CoA/CoA. Los trazadores radiactivos se pueden utilizar para medir las tasas de síntesis de CoA en las células. Los métodos actuales para medir los derivados de CoA y CoA en muestras biológicas se han revisado22 e incluyen ensayos espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografía líquida de alta presión y procedimientos basados en espectrometría de masas. Sin embargo, estos métodos a menudo se centran en especies moleculares de CoA particulares y son ciegos a la variación de la piscina total de CoA. Los ensayos enzimáticos acoplados generalmente requieren mayores cantidades de material de entrada debido a las sensibilidades de detección bajas y tienen un rango limitado de linealidad.
Nuestro laboratorio ha desarrollado un procedimiento fiable para la cuantificación del CoA total en células cultivadas y tejidos animales. La estrategia incluye hidrólisis de todos los tioesters de CoA para producir sólo CoA libre durante la preparación de la muestra, en lugar de hacer esfuerzos para mantener y analizar todo el espectro de especies de CoA. El procedimiento es una compilación de métodos individuales publicados para la preparación de muestras, derivación de CoA, purificación e identificación después de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), y cuantificación del CoA derivatizado por absorbancia o detección de fluorescencia23,24,25. Las determinaciones de CoA obtenidas mediante este procedimiento han permitido nuestra comprensión de la regulación del CdA y el desarrollo de un enfoque terapéutico para el tratamiento de las deficiencias de CoA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí demostramos un procedimiento fiable, paso a paso para cuantificar el CoA total en células y tejidos animales con una amplia gama de detección lineal que es accesible en muchos laboratorios que tienen un HPLC con un detector de salida de absorbancia o fluorescencia. Alternativamente, la espectrometría de masas es una técnica común para evaluar los tioesters de CoA y CoA, pero no está ampliamente disponible debido al costo de la instrumentación y los conocimientos especializados necesarios para el desarrollo d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la financiación para la investigación patrocinada proporcionada por CoA Therapeutics, Inc., una subsidiaria de BridgeBio LLC, la subvención de los Institutos Nacionales de Salud GM34496, y las Organizaciones Benéficas Asociadas Sirias Libanesas Estadounidenses.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
Riferimenti
- Abiko, Y., Greenburg, D. M. . Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4′-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) – Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
