Summary
Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.
Abstract
İmmünohistokimya hem normal gelişimsel hem de hastalık durumlarında protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Birçok immünohistokimya protokolü memeli doku ve doku bölümleri için optimize edilmiş olsa da, bu protokoller genellikle memeli olmayan model organizmalar için modifikasyon ve optimizasyon gerektirir. Zebra balıkları, gelişim süreçlerinin moleküler, genetik ve hücresel biyolojik mekanizmalarını araştırmak için temel, biyomedikal ve çevirisel araştırmalarda giderek daha fazla model sistem olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı bir model sistemi olarak birçok avantaj sunmak ama aynı zamanda optimal protein tespiti için modifiye teknikleri gerektirir. Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarda tam montaj floresan immünohistokimyası için protokolümüzü sağlıyoruz. Bu protokol ayrıca, istihdam edilebilen birkaç farklı montaj stratejisini ve her stratejinin sağladığı avantaj ve dezavantajlara genel bir bakışı açıklar. Ayrıca, tüm montaj dokusunda kromojenik substratların saptanmasını ve kesitli larva dokusunda floresan tespitine olanak sağlayacak değişiklikler de tanımlıyoruz. Bu protokol birçok gelişimevrelerinin ve embriyonik yapıların incelenmesi için geniş ölçüde geçerlidir.
Introduction
Zebra balığı(Danio rerio)kısa nesil zaman, hızlı gelişme ve genetik teknikler için amenability dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle biyolojik süreçlerin çalışması için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sonuç olarak, zebra balıkları genellikle toksikolojik araştırma ve ilaç keşif için yüksek iş ölçekli küçük molekül ekranlarda kullanılır. Zebra balığı aynı zamanda tek bir dişinin rutin olarak bir seferde 50-300 yumurta üretebildiği ve optik olarak berrak embriyoların gelişim süreçlerinin verimli bir şekilde görüntülenmesi için dışarıdan geliştiği göz önüne alındığında gelişimsel süreçlerin incelenmesi için de cazip bir modeldir. Ancak, erken araştırma n-etil-N-nitrozourea (ENU) veya diğer mutajenler ters genetik teknikler kurulmasında zorluklar nedeniyle kullanarak ileri genetik ekranlar çoğunlukla dayanıyordu. Kabaca yirmi yıl önce, morpholinos ilk zebra balığı nda hedeflenen genleri yıkmak için kullanılmıştır1. Morfolinonos erken gelişim aşamasında bir embriyo içine mikroenjeksiyon aşağıdaki hedef mRNA çeviri inhibe küçük antisense oligonükleotidler vardır. Morfolinoların en büyük zaafı, hücrelerin bölünmesiyle seyreltilmeleri ve genellikle döllenme sonrası (hpf) 72 saat etkisini kaybetmeleridir. Morpholos zebrabalığı gen bozulması için güçlü bir araç olmaya devam ederken, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs), çinko-parmak nükleazlar (ZFNs), ve düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) daha yakın zamanda doğrudan zebra balığıgenomu2,3hedef için kullanılmaktadır . Bu ters genetik stratejiler, ileri genetik ve yüksek iş elde ekranları ile birlikte, gen ekspresyonu ve fonksiyonu çalışma güçlü bir model olarak zebra balığı kurduk.
Gen fonksiyonunu inceleme yeteneği genellikle gen veya gen ürün ekspresyonunun spatio-temporal dağılımının değerlendirilmesi gerektirir. Erken gelişim sırasında bu tür ifade kalıplarını görselleştirmek için en sık kullanılan iki teknik yerinde hibridizasyon (ISH) ve tüm immünohistokimya (IHC) bulunmaktadır. In situ hibridizasyon ilk olarak 1969 yılında geliştirilmiştir ve birorganizmadamRNA ifadesini tespit etmek için etiketli antisense RNA problarının kullanımına dayanır 4 . Buna karşılık, etiketli antikorlar protein ekspresyonunu görselleştirmek için immünohistokimyada kullanılır. Algılama için proteinlerin etiketleme fikri 1930'ların5'ine kadar uzanır ve ilk IHC deneyi 1941'de FITC etiketli antikorların enfekte dokularda patojenik bakterileri tespit etmek için kullanıldığında yayınlanmıştır6. ISH ve IHC gelişti ve sonraki yıllarda önemli ölçüde geliştirilmiş ve şimdi her ikisi de rutin moleküler ve tanısal araştırma laboratuvarı7,8,9,10,11kullanılır . Her iki tekniğin de avantajları ve dezavantajları olsa da, IHC ISH üzerinde çeşitli avantajlar sunar. Pratik olarak, IHC ISH çok daha az zaman alıcı ve birincil antikor maliyetine bağlı olarak genellikle daha az pahalıdır. Buna ek olarak, mRNA ekspresyonu her zaman güvenilir bir protein ekspresyonu metomu değildir, çünkü farelerde ve insanlarda protein bolluğu varyasyonunun sadece üçte birinin mRNA bolluğu ile açıklanabileceği gösterilmiştir12. Bu nedenle, IHC ish verilerini onaylamak için önemli bir ektir, mümkün olduğunda. Son olarak, IHC ISH 13,14,15tarafından belirlenemeyen hücre altı ve eş yerelleştirme verileri sağlayabilir. Burada, zebra balığı embriyoları ve larvaları halinde immünohistokimya ile proteinleri güvenilir bir şekilde tespit etmek için adım adım bir yöntem tanımlıyoruz. Bu tekniğin amacı tüm embriyo ilgi bir proteinin mekansal ve zamansal ekspresyonu belirlemektir. Bu teknoloji antijene özgü primer antikorlar ve floresan etiketli ikincil antikorlar kullanır. Protokol, slayta monte edilmiş doku bölümlerinde ve floresan yerine kromojenik yüzeylerle kullanıma hazır dır. Bu protokolü kullanarak, biz zebra balığı iskelet kası gelişmekte olduğunu göstermek iyonotropik glutamat reseptörleri ifade eder, asetilkolin reseptörlerine ek olarak. NMDA tipi glutamat reseptör alt birimleri 23 hpf'de uzunlamasına kasüzerinde saptanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde tanımlanan zebra balığı yetiştiriciliği yetişkinler ilahı ve embriyolarla çalışma prosedürleri Murray State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Embriyo Toplama ve Fiksasyon
- Yetişkin zebra balığı karışık seks çiftleri veya grupları bir gecede sistem suyu yla dolu bir örgü veya oluklu astarile tanklara yerleştirerek yumurtlama tanklarını hazırlayın.
- Işıklar açıkken, dışkı kaldırmak için tatlı sistem suyu için yumurtlama tankı su değiştirin. 09:00'da ışıklar yanan 14 saat/10 h açık karanlık bir döngü kullanın.
- Yumurtalar yumurtladıktan sonra, yetişkinleri ev tanklarına geri döndürün.
- Bir transfer pipet kullanarak veya bir örgü süzgeç içine dökerek onları çizerek yumurta toplamak.
- Yumurtaları embriyo ortamıyla yarı yarıya doldurulmuş Petri yemeklerine (örneğin 0,5 mg/L metilen mavisi olan %30 Danieau veya E2 embriyo ortamı) aktarın ve çanak başına embriyo sayısını 50 ile sınırlandırın.
- Ölü ya da bölmek için başarısız herhangi bir yumurta çıkarın.
NOT: Ölü embriyolar opak hale geldikçe ve genellikle "bulutlu" göründükleri için kolayca tanımlanabilirler. Metilen mavisi embriyo ortamına eklenirse, ölü embriyolar koyu mavi bir görünüm edersiniz. - Yumurtaların 28.5 °C'de istenilen aşamaya ulaşınayına kadar kuluçkaya yatırın. Bu deney için, 23 hpf kadar embriyolar yükseltmek.
- İsteğe bağlı) Melanogenezi önlemek için embriyo larda 24 hpf ila 200 μM 1-fenil 2-tiourea (PTU) embriyoyutunur. Alternatif olarak, çamaşır suyu embriyoları fiksasyon sonrası (isteğe bağlı bölüm 5 bakınız).
- Günlük embriyo veya PTU ortamını değiştirin.
- Stereomikroskop altında ultra ince uçlu forceps kullanan dechorionate unhatched embriyolar. Alternatif olarak, kimyasal olarak embriyoları oda sıcaklığında birkaç dakika embriyo orta 1 mg/mL Pronase kuluçka ile dechorionate. Pronase gelen embriyolar çıkarın ve embriyo orta ile üç kez yıkayın.
- Dechorionated embriyolar plastik yapışacak. Embriyo ortamda çözünmüş% 1-2 agarose ile kaplanmış cam veya plastik Petri yemekleri saklayın. Hasarı en aza indirmek için ateşcilli Pasteur pipetleri kullanarak dechorionated embriyoları taşıyın.
- Embriyoları plastik veya ateş cilalı pipet kullanarak 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın.
- Bir mikropipet ile embriyo orta çıkarın. Sadece her sıvı değişikliğinden sonra embriyoları kapsayacak kadar sıvı bırakın.
- Kimyasal duman kaputunda 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
DİkKAT: PFA tehlikeli bir maddedir. Eldiven giyin ve kirlenmiş sıvıları ve katıları belirlenen alanlarda atın. - Oda sıcaklığında hafif sallanan ile 1-2 saat için% 4 PFA içinde embriyolar düzeltin. Alternatif olarak, embriyoları 4 saat ile geceye kadar 4 °C'de sabitler.
- 1x PBS + %1 Triton-X (PBTriton) içinde 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Embriyoları hemen kullanın veya 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
- Uzun süreli depolama için embriyoları %100 metanol (MeOH) 2 saat veya geceleme -20 °C'de susuz bırakın. Embriyoları -20 °C'de MeOH'da aylarca saklayın.
DİkKAT: MeOH tehlikeli bir maddedir. Eldiven giyin ve kirlenmiş sıvıları ve katıları belirlenen alanlarda atın.
2. Embriyo Hazırlama
- Oda sıcaklığında seri kuluçka yoluyla embriyolar rehydrate.
- 75% MeOH/25% 1x PBS 5 dakika, sallanan incubate.
- 5 dakika için% 50 MeOH/50% 1x PBS inkübat, sallanan.
- 5 dakika için% 25 MeOH/75% 1x PBS incubate, sallanan.
- 5 dakika için% 100 PBTriton inkübat, sallanan.
- (İsteğe bağlı) 10 μL taze çözülmüş proteinaz K stoğu (10 mg/mL) ekleyerek buz üzerinde taze proteinaz K çalışma çözeltisi (PBTriton'da 10 μg/mL) hazırlayın.
- Proteinaz K'de 30 dk'ya kadar sindirerek embriyoları permeabilize edin.
NOT: Önerilen zamanlama <24 hpf: hiçbir sindirim; 24 hpf: 15 dk sindirim; ve 7 günlük: 30 dk sindirim. - PBTriton'da permeabilize embriyoları durulayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 PFA'da yeniden düzeltin.
- Embriyoları PBTriton'da üç kez oda sıcaklığında hafif sallanan 5 dakika yıkayın.
- Proteinaz K'de 30 dk'ya kadar sindirerek embriyoları permeabilize edin.
3. Primer Antikor Kuluçka
- 2 mg/mL Sığır Serum Albumini (BSA) olan veya olmayan ikincil antikor konak türlerine (pbtriton'da %10 keçi serumu) uyan ticari bir engelleme solüsyonu veya serum seçin.
- Embriyoları blokçözeltisinde oda sıcaklığında 1-3 saat veya geceboyunca 4 °C'de sallayarak engelleyin.
- Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş primer antikorda kuluçka veya pbtriton'da bir gecede 4 °C'de %1 serum sallanırken. Bu deneyde kullanılan birincil antikorlar anti-NMDAR1, anti-pan-AMPA reseptörü ve antifosfo-Histon H3 idi ve her biri PBTriton'daki %1 keçi serumunda 1:500'lük son konsantrasyona seyreltildi.
- Sallarken pbtriton'da 10 dakika oda sıcaklığında beş kez yıkayın.
4. Sekonder Antikor Kuluçka
- Birincil antikor ve istenilen dalga boyu konak türlerine göre ikincil bir antikor seçin.
- Bloklama çözeltisi içinde seyreltilmiş ikincil antikorveya %1 serumda oda sıcaklığında (veya geceleme 4 °C'de) sallanırken 2 saat boyunca inküler.
NOT: Floresan sekonder antikorlar ışığa duyarlıdır. Biz PBTriton% 1 keçi serum seyreltilmiş 1:500 keçi-anti-fare Alexa488 kullanılır. - Bu ve sonraki tüm adımlar için bir ışık engelleme kutusu ile boruları alüminyum folyo veya kapak kapağı ile kaplayın.
- Sallarken pbtriton'da 10 dakika oda sıcaklığında üç kez yıkayın.
- Embriyo orta% 2 agarose bir yatak üzerinde PBS bir% 50 gliserol çözeltisi embriyolar transferi ve belgelere devam veya aşağıdaki daha fazla işleme adımları devam.
İsteğe Bağlı Adımlar
5. Beyazlatma
- 810,7 μL ddH2O, 89,3 μL 2 M KOH ve %30 H2O2'lik100 μL ekleyerek 1,5 mL'lik bir tüpte çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın.
- Tüpü karıştırmak için üç kez ters çevirin.
- Pipet 1 mL çamaşır suyu çözeltisi yönde embriyolara.
- Gazın kaçabilmesi için embriyo tüp kapağını açın. Kabarcıkları çıkarmak için tezgahtaki tüpü hafifçe dokunun.
- Ağartma işlemini izleyin (gerekirse mikroskop kullanın) ve pigment yeterince çıkarıldığında reaksiyonu durdurun (24 hpf için yaklaşık 5 dk veya 72 hpf için 10 dk).
- Bir mikropipet ile beyazlatma çözeltisini dikkatlice çıkarın ve pbtriton 1 mL üç kez embriyoları durulayın.
NOT: Embriyolar bu adımda yapışkandır. - Aşağıdaki belgelere veya daha fazla işleme adımlarına devam edin.
6. Embriyo Diseksiyon ve Deyolking
- Sarısını çıkarmak için, küçük bir miktar transfer (~ 200 μL veya tamamen embriyo kapsayacak şekilde yeterli ama yüzebilir nerede sınırlamak için yeterince kısıtlayıcı) bir depresyon slayt veya düz bir cam slayt 1x PBS.
- PBS damlacık 1 veya daha fazla embriyo taşımak için plastik bir transfer pipet kullanın.
- Sarısı parçalamak ve çok yavaşça embriyonun ventral yüzeyinden sarısı granülleri kazımak için ultra ince çalgılar ve 00 böcek pimleri kullanın (ayrıca cheng ve ark., 2014 bakınız)18.
- Sarısı granüllerini çıkarın ve gerektiğinde PBS'yi yeniler.
- Embriyo yeterince sarısı ücretsiz olana kadar tekrarlayın.
7. Slaytlarda Düz Montaj
- Deyolked embriyoları plastik pipetli yüklü bir cam kaydırağa veya kesilmiş uçlu 1 mL mikropipete (kesme gerilimini azaltmak için) aktarın. 200 μL mikropipet ucu veya böcek pimi ile iskan edilen orient.
- Wick uzakta bir Kim mendil veya kağıt havlu ile aşırı PBS.
- Slayt ve coverslip montaj ortamı 2-3 damla ekleyin.
- Hava yaklaşık 5-10 dakika kuru.
- Kapak camı şeffaf ojeile kaydırağın üzerine kapatın.
NOT: Kapak camı kenarları tamamen ince, sürekli bir oje tabakası ile kaplanmalıdır. - Görüntülemeden önce yaklaşık 10 dk kurumasını bekleyin.
8. Agarose Montaj
- Embriyo ortasında, mikrodalga da güvenli bir şişeye veya istenilenden en az 3 kat daha fazla hacimde bir kabın 50 mL'sine 0,5 g agarose ekleyerek %1 agarose hazırlayın.
- Bir mikrodalga ısı, her 30 s dönen, agarose tamamen çözülmüş kadar.
- 1,5 mL santrifüj tüplerinde 1 mL aliquot yapın. Aliquots oda sıcaklığında saklayın.
- Isıtmadan önce kapak kilitleri ile kapak kapakları.
- Agarose tüpleri yüzer bir tüp tutucuya, yarı su dolu bir kabın içine yerleştirin.
- Mikrodalga 2-3 dakika yüzen tüpler ile beher, ya da agarose tamamen eriyene kadar.
- Bir embriyoyu plastik bir pipet veya kesilmiş uçlu 200 μL mikropipetle köprülü kaydırağa aktarın (kesme gerilimini azaltmak için).
- Embriyoyu böcek pimleri kullanarak dikdörtgen bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve doğrudan embriyoya yaklaşık 20 μL erimiş agarose ekleyin.
- 00 böcek pimi kullanarak kapak kaymasına en yakın ilgi bölgesini hızla yönlendirin.
NOT: Bu baş aşağı bir montaj. - Agarose tüpünü her kullanım ve mikrodalga arasında sıcak su tüpü şamandırasına gerektiği gibi geri getirin.
- Agarose sertleşir zaman bir mikroskop kullanarak görüntü. Monte edilmiş embriyoyu ters bir mikroskopta kullanmak için baş aşağı tutun. Kapak kapağını ters mikroskoplarda kullanmak için (agarose coverslip'in altında olması için) çevirin.
9. Köprülü Slaytlara Montaj
- Köprülü slaytlar yapmak için, yapıştırıcı kare superglue küçük bir nokta kullanarak cam slayt kapakları.
NOT: Kapaklar arasında en az 5 mm genişliğinde bir çukur olmalıdır. İki #1 kapakları yüksek genellikle 24-48 hpf embriyolar için uygundur, üç coverlips yüksek 72 hpf için gerekli olabilir. - 1-2 deyolked embriyoları plastik bir pipet veya kesilmiş uçlu 200 μL mikropipet (kesme gerilimini azaltmak için) ile köprülü slayta aktarın.
- Wick uzak bir Kim mendil veya kağıt havlu ile aşırı sıvı.
- Doğrudan embriyoya ≥80% gliserol bir damla ekleyin.
- Dikdörtgen kapak camı ile kaplayın. Gliserol damlacık kapak cam dokunmak gerekir.
- Tamamen embriyo tarafında gliserol marjı ile embriyo kapsayacak şekilde gerekli olduğu gibi kapak cam ve slayt arasındaki alana daha fazla gliserol ekleyin.
- Embriyoyu görüntüleme pozisyonuna getirmek için dikdörtgen kapak camı yavaşça kaydırın.
10. DAB Boyama
NOT: Bu bölüm yukarıdaki adım 4.2'den sonra başlar ve 4.
- Embriyoları, terleme sırasında oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de peroksidaz konjuge ikincil antikor ile bloke edici bir çözeltide kuluçkaya yatırın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika PBTriton üç kez yıkayın.
- Embriyoları bir kültür plakasına veya bir transfer pipetle depresyon slaytına aktarın.
- DDH2O ve %0,3 hidrojen peroksit 50 μL çözünmüş % 1 DAB (3,3'-diaminobenzidin) karışımı ve PBS ile 1 mL getirmek.
DİkKAT: DAB tehlikeli bir maddedir. Eldiven giyin ve DAB'nin kirlenmiş sıvıve katılarını belirlenen alanlarda imha edin. - Yukarıda hazırlanan DAB çözeltisi ile HRP lekeli embriyoları kapatın ve mikroskop altında renk gelişimi (genellikle 1-5 dk) için monitör.
- İstenilen renk gelişimi seviyesine ulaştıktan sonra, embriyoları Kısaca PBS'de durula.
- Embriyoları fiksasyondan önce 1,5 mL'lik bir tüpe geri aktarın.
- Oda sıcaklığında %4 PFA'da 15-20 dk embriyoları yeniden düzeltin.
- Embriyoları PBTriton'da 3 kez 5 dakika yıkayın.
- Belgelere devam edin.
11. Slaytlara Monte Edilen Kesitli Dokunun Boyandırılmasını Sağlayacak Modifiye Protokol
- Bir pap kalem ile lekeli olmak için doku çevreleyen.
- Slaytları nemli bir odaya aktarın.
- Doğrudan slayta 1 mL PBS ekleyin.
- Katıştırma ortamını çıkarmak için oda sıcaklığında 7 dk kuluçkaya yatın.
- Slayt ters çevirerek PBS dökün.
- 1 mL'ye kadar TNT tamponu (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, %0.1 Ara 20) 1 dk rehydrate.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1 mL'ye kadar bloklama çözeltisi (ticari veya %10 serum + %2 BSA) bloke edin.
- %1 serumda seyreltilmiş primer antikorda veya 4 °C'de tıkanan çözeltide bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Oda sıcaklığında 1 mL'ye kadar TNT tamponu beş kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında veya geceleme 4 °C'de 2 saat boyunca ikincil antikorda kuluçkaya yatırın. Folyo ile oda kapağı veya koyu bir kapak kullanın.
- Oda sıcaklığında TNT beş kez yıkayın. Son yıkamayı dökün.
- Montaj orta ve coverslip 2-3 damla ile Monte. 5-10 dk oturalım.
- Kapak camı açık oje kullanarak kaydırağın üzerine kapatın. Görüntülemeden önce tamamen kurumasını bekleyin.
12. Dokümantasyon
- Tüm prosedürü ve sapmaları laboratuar not defterine kaydedin.
- Birincil antikorkonsantrasyonu, adını, katalog numarasını, üreticisini ve lot numarasını kaydedin.
- Uygun monte edilmiş numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. İlgi çekici bölgeyi bulun.
- Nispeten parlak bir örnek seçin. Kamera pozlamasını ayarlayın ve sinyalin doymadan yeterince parlak olması için kazanç elde edin.
- Deneysel antikor etiketli embriyolar ve kontrol antikor (ex. IgG) embriyoları arasında karşılaştırma yaparken aynı maruzkalma ayarlarını kullanarak aynı ilgi bölgesinin boyama yoğunluğunu karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm monte immünohistokimya bozulmamış hayvan protein ekspresyonunun mekansal desen tespit etmek için antikorlar kullanır. İmmünohistokimyanın temel iş akışı (Şekil 1'degösterilmiştir) zebra balıklarının üremesini, embriyoların yetiştirilmesini ve hazırlanmasını, spesifik olmayan antijenlerin engellenmesini, ilgi proteinini hedeflemek için antijene özgü bir primer antikor kullanılmasını, etiketlenmiş ikincil antikorla birincil antikortespit ini, numuneyi monte etmeyi ve ifadeyi belgelemeyi içerir.
Tüm monte immünohistokimya zebra balığı gelişimi sırasında mekansal ve zamansal protein ekspresyonu çalışması için değerli bir araçtır. Zebrabalıkları 19 hpf'den önce başlayan boşluk kavşakları ile aracılık eden spontan kasılmalar sergiler - motor nöron teması ndan önce19. Zebrabalığı nöromüsküler kavşak, diğer omurgalılar gibi, nikotinik asetilkolin reseptörlerinde hareket asetilkolin aracılık. Bu birleştirilmiş reseptörler ilk olarak yaklaşık olarak tespit edilir 16 hpf ve ekspresyon genişler ve nöronlar temas20formu olarak remodels . Kurbağalar21 vesıçan22 çalışmalar omurgalıların iskelet kası da iyonotropik glutamat reseptörlerini ifade edebilir öneririz. NMDA tipi glutamat reseptörünün GluN1 alt birimi için tüm monte immünohistokimya, 23 hpf'de zebrabalığı kası nın geliştirilmesi boyunca glutamat reseptör alt birimlerinin ekspresyonunu ortaya çıkarır (Şekil 2). Bu motor nöron innervasyonu zamanlaması ile yaklaşık karşılık gelir. Ekspresyon, balığın arka plan floresansını ve sekonder antikorunu belirlemek için birincil kontrol embriyosu ve nonspesifik antijen bağlanmasının göreceli katkılarını belirlemek için 2 μg/mL fare IgG ile karşılaştırıldı. Ampa tipi glutamat reseptörleri gelişimin bu aşamasında kaslarda tespit edilmedi. Antikor konsantrasyonları Tablo 1'delistelenmiştir. Bu görüntüleri oluşturmak için, bu embriyolar deyolking dışında isteğe bağlı adımların hiçbiri ile bu protokolde açıklandığı gibi işlenmiştir. Embriyolar düz monte edilmiş ve örtülüidi (Şekil 3B).
Bölen hücreler, protein fosforilasyon gibi belirli modifikasyonları tanıyan antikorlar kullanılarak immünohistokimya ile tespit edilebilen, kuskan hücrelerden farklı histon modifikasyonları ifade eder. Serin 10'da histonin 3 fosforilasyon hücre bölünmesi ile ilişkilidir23. Larva zebrabalığı beyninde çoğalan hücreleri tespit etmek için, immünohistokimyanın slaytlara monte edilen kesitli dokuya uyarlanabilmek için bu protokole sunulan modifikasyonlar kullanılmıştır. 72 hpf embriyonun dondurulmuş bölümleri slaytlara monte edilmiş ve p-H3 için immünostained(Şekil 4). Çeşitli hücreler p-H3 ifade, ve ifade ventriküler bölgelerde en önemli. Ekspresyon nonspesifik antijen bağlanmasının göreceli katkılarını belirlemek için primer kontrol embriyosu ve 2 μg/mL fare IgG ile karşılaştırıldı.
| Antikor | Hedef | Konsantrasyon |
| Fare IgG Izotip Kontrolü | Spesifik olmayan antijenler | 2 μg/mL |
| Fare anti-NMDAR1 | GluN1 alt birimi | 1:1,000 |
| Keçi anti-fare Alexa488 | Fare IgG | 1:500 |
| Fare Anti-fosfo-H3 | fosforilted Histone H3 | 1:500 |
| Fare Anti-pan-AMPA reseptörü | GluR1-4 | 1:500 |
Tablo 1: Kullanılan antikor ve konsantrasyonların listesi.
Şekil 1: Tüm monte immünohistokimya prosedürünün akış şeması. Prosedürün temel iş akışı balık yetiştirmektir; embriyoları toplamak ve hazırlamak; spesifik olmayan antijenleri bloke etmek; primer ve sekonder antikorlarda seri olarak kuluçka; doku montaj; ve belge. İsteğe bağlı adımlar, iş akışındaki uygun noktada küçük oklarla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Larva şeması ve NMDA reseptör IHC temsilcisi sonuçları. Tüm monte immünohistokimya kullanımı gelişmekte olan kas glutamat reseptör ekspresyonu test etti. 23 hpf'de oryantasyon ve ilgi alanı belirtilir. Primer antikorlar dahil edilmezken sinyal tespit edilemedi. Fare IgG kontrol antikornonspesifik olmayan ifade düşük düzeyde gösterir. NMDA tipi glutamat reseptörünün (NMDAR) GluN1 alt birimi gelişmekte olan kas boyunca ifade edilir, somit sınırları yüksek konsantrasyonlarda (ok başları). AMPA tipi glutamat reseptörleri (AMPAR) bu aşamada ifade edilmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Montaj şemalarının şeması. (A) Bir embriyo 50% gliserol battı kolayca yeniden konumlandırılabilir. (B) Montaj ortamına düz monte edilmiş bir embriyo daha sonraki bir tarihte korunabilir ve görüntülenebilir. (C) Bir embriyo% 1 agarose bir damlacık monte zor bir bölge görüntülemek için pozisyonda sabit olabilir. (D) Bir embriyo gliserol bir köprü slayt üzerine monte haddelenmiş ve yeniden konumlandırılmış olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kesitli dokuda IHC'nin temsili sonuçları. İsteğe bağlı adımlarda protokol değişiklikleri kullanılarak, immünohistokimya 72 hpf zebrabalığı larva beyninde çoğalan hücreler için test edilmiştir. Fare IgG kontrol antikor ve primer antikorlar hariç non-spesifik ifade düşük düzeyde ortaya koymaktadır. Çoğalan hücrelerin bir belirteç olarak, p-H3 ventriküler bölgeler (ok ucu) da dahil olmak üzere ayrı konumlarda ifade edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İmmünohistokimya bir organizmada ilgi hemen hemen herhangi bir protein in spatio-temporal ifade karakterize etmek için kullanılabilecek çok yönlü bir araçtır. İmmünohistokimya dokular ve model organizmaların geniş bir yelpazede kullanılır. Bu protokol zebra balıklarında kullanılmak üzere optimize edilmiştir. Farklı türlerde immünohistokimya farklı fiksasyon ve işleme teknikleri, türlere ve endojen peroksidazların varlığına bağlı olarak çözümler engelleme ve dokuların kalınlığı ve bileşimi nedeniyle kuluçka süreleri gerektirebilir. Zebra balığı IHC kanser anlayışımızı ilerletmede ayrılmaz olmuştur24, metabolik hastalık25, nörolojik bozukluklar26, ve insan sağlığı için büyük alaka çok sayıda diğer alanlarda. IHC için önemli bir avantajı prosedürü nispeten ish gibi diğer teknikler ile karşılaştırıldığında kısa ve teknik olarak zorlu değildir. Ancak, örneklerin yaşına, hedeflenen antijene ve kullanılan antikorlara bağlı olarak optimizasyon gerektiren çok sayıda adım vardır.
Bu protokoldeki birkaç adımın süresi esnektir. Belirtildiği gibi esnek adımlar için verilen süreler genellikle gereken en az süreleri temsil eder. Genel olarak, embriyolar PBTriton'da üç veya daha fazla kez yıkandığında, gerekirse son yıkamada 4 °C'de geceleme yapılabilir. Permeabilization ve fiksasyon süreleri daha az esnektir ve sorun giderme stratejisinin bir parçası olarak yalnızca kasıtlı olarak ayarlanmalıdır. Bu adımların deneysel olarak alakalı olduğu şekilde iş akışına nasıl entegre edilebildiğini göstermek için protokolde isteğe bağlı birkaç nokta kaydettik. Örneğin, pigmentasyon sinyal algılamayı engelliyorsa, PTU tedavisi veya çamaşır suyu sabit embriyolar ile melanojeni önleyin. Beyazlatma dokuya zarar verebilir, bu nedenle embriyoların çamaşır suyunda geçirdikleri zamanı en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır. Ancak, ağartma PTU tedavisi için tercih edilebilir, hangigelişmeninbazı yönlerini etkileyebilir 27,28,29,30. Ayrıca floresan ve kromojenik algılama için seçenekler salıyoruz. Floresan istenmezse veya antijen floresan mikroskopisi ile yeterince tespit edilemeyecek kadar zayıf bir sinyal üretiyorsa, antetli peroksidaz (HRP)konjuge antikor ve DAB kullanılarak kromojenik saptama sağlanabilir.
Zebra balıklarında IHC'nin en büyük sorunu uygun antikorlar bulmaktır. Gerçekten de, ISH genellikle ticari antikorlar ilgi istenilen protein için mevcut değildir protein ekspresyonu için bir proxy olarak kullanılır. Birçok ticari antikor memeli hedefleri hedef için tasarlanmıştır ve epitopsher zaman zebra balığı korunmuş değildir. Varsa, zebra balıklarında test edilmiş ticari olarak mevcut antikorları seçin. Zebra balığı ile hedef türler arasında %gt;80 korunmuş antijenleri tanıyan antikorların genellikle zebra balıklarında çalıştığını bulduk. Ayrıca, memelilerin yanı sıra kuşlarda ve/veya amfibilerde de işe yverdiği gösterilen antikorların, zebra balıklarındaki etkinlik test edilmemiş olsa bile genellikle zebra balıklarında da işe yarayacağını bulduk. Tipik olarak, bir memeli antijenine karşı geliştirilen poliklonal antikorların zebra balığı homologlarını algılama olasılığı düşük özgüllükleri nedeniyle monoklonal antikorlara göre daha yüksektir. Yeni bir antikor test edildiğinde, çapraz bağlı bir hedef peptid, memeli doku veya protein ifade bilinen hücreler kullanarak pozitif bir kontrol deneyi çalıştırmak için yararlıdır, ya da bir muhabir inşa ifade hücreleri. Antikorlar da hedef antijen boyutunu doğrulamak için batı leke tarafından test edilebilir.
Çoğu ticari antikor IHC için önerilen seyreltme aralığı sağlarken, ampirik olarak en iyi çalışan seyreltme belirlemek önemlidir. Çok yüksek olan antikor konsantrasyonları genellikle spesifik olmayan boyama ve artan arka plan neden, çok az antikor fark sinyali sağlamak için başarısız iken. Antikor ve antijene bağlı olarak, yukarıdaki adım 3.2'de açıklandığı gibi embriyoları ilk olarak permeabilize etmek avantajlı olabilir, ancak bu adım gerekli olmayabilir ve bazı durumlarda sinyalazalmasına neden olabilir. Bu protokol, Triton-X-100'ün hücreleri permeabilize eden ve ince doku veya yüzeysel ifade için yeterli olabilecek bir deterjan olarak kullanılmasıdır. Derin beyin bölgeleri veya daha yaşlı larvalar gibi derin veya kalın doku, proteinaz permeabilizasyonu gerektirebilir. Buna karşılık, Triton-X-100 hücre içi proteinlerin etiketedilmesi üzerinde sadece hücre yüzeyindeki proteinlerin immünboylaması istendiğinde tüm adımlardan dışlanmalıdır. Engelleme adımının süresi ve serum ve BSA kullanarak karşı ticari bir engelleme çözeltisi seçimi de antikor duyarlılığı ve arka plan boyama için düzeltmek için ayarlanabilir. Engellemede kullanılan yüksek serum konsantrasyonları (%bu protokolde %10) arka plan boyamasını azaltabilir, ancak maskeleme antikor bağlama bölgelerini en aza indirmek için antikor bulunduğunda seyreltilmelidir. Arka plan sinyali düşük antikor seyreltmelerde bile (<1:1,000) sürekli olarak yüksekse bitki bazlı engelleme çözümleri yararlı olabilir. Son olarak, hassasiyet yıkar sıkılığı ile ince ayar lı olabilir. Antikor sonrası yıkama adımlarının süresini artırmak veya azaltmak ve PBTriton'daki Triton-X-100 miktarını ayarlamak gerekebilir. PBTriton span tipik çalışma aralıkları 0.2% için 1.0% Triton-X-100. Negatif kontrol embriyolarını primer IgG ile lekelemek için yeni bir antikor kullanırken ve antikor özgüllüğünü belirlemek ve potansiyel yanlış pozitif sinyalleri belirlemek için ikincil antikorlar etiketli iyi bir uygulamadır.
Antikor optimizasyonu olumlu bir sinyal üretmek için başarısız olursa, antijen maskeleme fiksatif nedeniyle olabilir. Genellikle, 4% PFA fiksasyon antikor bağlanmasını önlemek için antijen siteleri maske değildir, antijen maskeleme bazen bazı antikorlar ile meydana rağmen. Antijen alma embriyo hasara neden olabilir ama bir çalışma protokolü Inoue ve Wittbrodt31tarafından tarif edilmiştir. Alternatif olarak, seçilen antikor % 4 PFA ile uyumsuz ise veya PFA hücresel morfoloji değişiklikleri ile sonuçlanırsa, metanol, 2% trikloroasetik asit, veya glyoaxal örnekleri düzeltmek için kullanılabilir27. Bir antikorun formaldehit fiksasyonu ile uyumluluğu ampirik olarak belirlenmelidir. PfA fiksasyonu ndan sonra pozitif kontrol sinyali alınamıyorsa, metanol gibi alternatif bir fiksatif denemeye değer olabilir. Konjuge antijenlere karşı yükseltilen primer antikorlar için alternatif fiksasyon protokolleri de gerekli olabilir (GABA-BSA gibi).
Görüntüleme için immünostained zebrabalığı embriyoları montaj için çeşitli etkili seçenekler vardır. Embriyolar gliserol bir Petri çanak transfer edilebilir, iğne veya forceps ile konumlandırılmış, ve ters bir mikroskop ile çanak ile görüntüleme yukarıdan veya altından geniş bir alan görünümü ile görüntülenebilir(Şekil 3A). Bu yöntem basit, hızlı ve geçicidir. Sakıncaları sıvı gliserol odak dışarı rulo embriyolar için eğilimi dahil, çanak gliserol yüzeyinden potansiyel yansımaları, ve kalın çanak ile görüntüleme zorluğu. Embriyolar cam kenarlara düz monte edilebilir(Şekil 3B)montaj ortamı, kapaklar ve oje ile. Bu bağlar dik veya ters bir mikroskop üzerinde görülebilir. Bu şekilde hazırlanan embriyolar önceden hazırlanabilir ve slaytlar görüntülemeye kadar 4 °C'de saklanabilir veya daha sonra depolanıp yeniden görüntülenebilir. Görüntüleme süresi sınırlı olduğunda bu özellikle avantajlı olabilir. Bu montaj dezavantajları embriyo pozisyonu ve doku kalınlığı için sınırlı seçenekler, ve yetersizlik yeniden konumlandırma veya embriyokurtarmak için içerir. Bu şekilde monte edilen embriyolar genellikle deyolking gerekir, sarısı granüller en sık kullanılan floresan kanallarında otofloresan ve montaj dan sonra hareket ettirilemez veya kaldırılamaz. İlgi bölgesi embriyonun zor konumlandırılmasını gerektirdiğinde, embriyoların bir kapak camı üzerine %1 agarose monte edilmesi en avantajlı olabilir(Şekil 3C). Embriyo agarose soğuyana kadar kapak camı en yakın ilgi bölgesi ile böcek pimleri ile pozisyonda tutulabilir. Agarose embriyo yuvarlayarak en az birkaç dakika pozisyonda tutacak. Agarose montaj ters mikroskoplar için en iyisidir, kapak cam dik bir mikroskop üzerinde kullanılmak üzere dikkatle ters olabilir rağmen. Bu montaj zaman alıcı olabilir ve embriyolar genellikle yeniden konumlandırılabilir veya kurtarılabilir değildir. Köprülü slaytlara embriyo ların monte sayılsa da(Şekil 3D)bu yöntemler arasında bir miktar uzlaşma sağlar. Köprülü montaj hızlıdır ve embriyolar yeniden konumlandırılabilir ve kurtarılabilir. Köprünün yüksekliği düz bağlardaha doku kalınlığı ve embriyo pozisyonunda daha fazla esneklik sağlarken, yukarıdan veya aşağıdan görüntü yeteneğini koruyabilir. Bu yöntem, köprülü slaytların önceden hazırlanmasını gerektirir. Monte edilecek dokunun kalınlığı köprünün kaç kapak yüksekliğinde olması gerektiğini belirler. Köprülü slaytlar bir gün için birkaç kez yeniden kullanılabilir ama gliserol slaytlar temizlemek zordur ve yavaş yavaş köprü tutan tutkal yerinden çünkü görüntüleme oturumundan sonra bertaraf edilmelidir.
IHC, bir organizma veya dokudaki protein ekspresyonunun zamanlamasını ve deseni belirlemek için etkili bir yöntemdir. IHC nispeten düşük maliyetli ve ish (2-3 gün karşı 5-8 gün) için gerekli zaman bir kısmını tamamlanabilir ISH üzerinde çeşitli avantajları vardır. Buna ek olarak, IHC gen ürün ekspresyonunun daha iyi bir göstergesidir, çünkü mRNA düzeylerinin saptanması protein ekspresyonunu etkileyebilecek posttranskripsiyonel ve posttranslational süreçleri öngörmez. IHC ayrıca hücresel yerelleştirme verilerini (DAB boyama kullanırken bu doğru olmasa da) sağlama yeteneğine sahiptir ve bu da ISH tarafından karşılanmaz. Zebra balıklarında çift ISH/IHC yapmak mümkündür.
IHC de bazı dezavantajları vardır, aralarında en önemlisi antikor durumu olmak. IHC için uygun kalitede çok sayıda antikor bulunmasına ragirse, özellikle zebra balıklarında çalışan antikorların bulunması daha zordur ve genellikle memeli antijenlerine karşı üretilen antikorların test edilmesi ve giderilmesi gerekir. Bununla birlikte, piyasada doğrulanmış antikorların sayısı giderek artmakta ve CRISPR/Cas9 teknolojisinin ortaya çıkması genom mühendisliği yoluyla endojen proteinlerin epitopesini mümkün kılmıştır. Ancak bu süreçler zaman alıcı ve zorludur ve protein fonksiyonunun doğrulanmasını gerektirir.
Bu raporda açıklanan protokol, herhangi bir aşamada zebra balığı embriyoları ve larvalar üzerinde geniş ölçüde kullanılabilir ve yetişkin hayvanların dokularına da uygulanabilir. Buna ek olarak, bu protokol aynı zamanda az değişiklik ile dondurulmuş veya parafin kesitli örneklerin boyanmasına olanak sağlar. Tüm monte immünohistokimya kas nörotransmitter reseptör popülasyonları incelemek için kullanılan, zebrabalığı kas gelişmekte olan iyonotropik NMDA glutamat reseptör zorunlu alt birim 1 ekspresyonu ortaya. Gelişmekte olan kas genelinde bu oldukça yaygın ve yaygın boyama Kenopus larvaları gelişmekte olan aynı reseptör alt biriminin gelişimsel ekspresyonu ile tutarlıdır21. Bu gelişmekte olan kas glutamat reseptörlerinin ekspresyonu evrimsel olarak korunmuş olduğunu göstermektedir. Bu protokol, IHC kullanımı yoluyla gen ekspresyonunun daha iyi anlaşılması için değerlidir ve zebra balıklarında protein ekspresyonunun spatio-temporal dağılımını belirlemek için güçlü bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir bilgileri yok.
Acknowledgments
NIH hibe 8P20GM103436 14 fon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
References
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J.
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
