Crescimento de Camadas de Células Endoteliais De Córnea Humana e Ovelha em Membranas Biomateriais

Summary

Este protocolo descreve os passos críticos necessários para estabelecer e cultivar culturas de células endoteliais da córnea a partir de explantas de tecido humano ou ovino. Também é apresentado um método para subculindo células endoteliais córneas em biomateriais membranrosas.

Abstract

As culturas de células endoteliais da córnea tendem a se submeter à transição epitelial-mesenquimal (EMT) após a perda do contato celular-célula. O EMT é deletério para as células, pois reduz sua capacidade de formar uma camada madura e funcional. Aqui, apresentamos um método para estabelecer e subculir culturas de células endoteliais de córnea humanas e ovelhas que minimizam a perda do contato celular-célula. Explantas de endotelio córnea/membrana descemet são retiradas de córneas doadoras e colocadas na cultura tecidual em condições que permitem que as células migrem coletivamente para a superfície cultural. Uma vez estabelecida uma cultura, as explantas são transferidas para placas novas para iniciar novas culturas. Dispase II é usado para levantar suavemente aglomerados de células das placas de cultura do tecido para subculturing. Culturas de células endoteliais da córnea que foram estabelecidas usando este protocolo são adequadas para transferência para membranas biomateriais para produzir camadas celulares projetadas por tecido para transplante em ensaios em animais. Um dispositivo personalizado para suportar membranas biomateriais durante a cultura tecidual é descrito e um exemplo de um enxerto projetado por tecido composto por uma camada de células endoteliais da córnea e uma camada de células estrôquias córneas em ambos os lados de uma membrana do tipo I de colágeno é apresentada.

Introduction

A córnea é um tecido transparente que está situado na frente do olho. É composto por três camadas principais: uma camada epitelial na superfície externa, uma camada de estroma médio e uma camada interna chamada endotelio córnea. O endotelio córnea é uma monocamada de células que fica em uma membrana do porão chamada membrana de Descemet e mantém a transparência da córnea regulando a quantidade de fluido que entra no estrume do humor aquoso subjacente. Muito fluido dentro do estrume causa inchaço na córnea, opacidade e perda de visão. O endotelo é, portanto, vital para manter a visão.

O endotelo córnea pode se tornar disfuncional por uma série de razões, incluindo envelhecimento, doença e lesão, e o único tratamento atual é a cirurgia de transplante. Durante esta cirurgia, o endotelo e a membrana de Descemet são removidos da córnea do paciente e substituídos por um enxerto de endotelio e a membrana de Descemet obtida de uma córnea doadora. Muitos enxertos de endotelio também contêm uma fina camada de tecido estrônio para ajudar no manuseio e afixação à córnea^{hospedeira 1}.

Em todo o mundo, a demanda por tecido doador de córnea para cirurgias de transplante é maior do que a quantidade que pode ser fornecida pelos bancos oculares². Por isso, houve um impulso para desenvolver transplantes de endotelio de córnea projetados por tecido que poderiam ser usados para aliviar essa carência³. A lógica para isso baseia-se no fato de que, atualmente, o endotelo de uma córnea individual só pode ser transferido para um único paciente, no entanto, se as células endoteliais da córnea foram expandidas e cultivadas pela primeira vez em andaimes biomateriais na cultura tecidual, elas poderiam ser usadas para tratar vários pacientes.

Os principais desafios que precisam ser enfrentados antes que transplantes de endotelio de córnea projetados por tecido se tornem uma opção viável para os cirurgiões incluem: (1) estabelecer técnicas para expandir células endoteliais da córnea de alta qualidade e para a produção de maduros e camadas funcionais de células endoteliais in vitro, e (2) estabelecendo técnicas para o cultivo das células em andaimes biomateriais para produzir enxertos projetados por tecido que são iguais, ou melhores do que, os enxertos derivados da córnea doador que são usados atualmente.

As células endoteliais da córnea têm um potencial proliferativo muito baixo in vivo, mas podem ser estimuladas a dividir in vitro⁴. No entanto, eles têm uma forte tendência a se submeter à transição epitelial in vitro para messínquimal (EMT), que reduz sua capacidade de formar uma camada endólial madura e funcional. Os gatilhos conhecidos para EMT em células endoteliais da córnea incluem exposição a certos fatores de crescimento e perda do contato celular-célula⁵. É, portanto, quase inevitável que as culturas de células endoteliais da córnea que são enzimáticamente dissociadas durante a subcultura sofrerão mudanças associadas à EMT. Aqui, apresentamos um método de cultura celular para células endoteliais de córneas humanas ou ovelhas que foi projetada para minimizar a interrupção dos contatos entre células durante estágios de isolamento, expansão e subcultura, para reduzir o potencial para a EMT. Além disso, demonstramos como enxertos projetados por tecido que se assemelham ao endotelo derivado de córnea/enxertos de tecido estrônico da Descemet podem ser produzidos pelo cultivo de camadas de células cultivadas em ambos os lados de uma membrana biomaterial em um dispositivo de montagem personalizado.

Protocol

Córneas humanas com consentimento de doadores para pesquisa foram obtidas do Queensland Eye Bank e usadas com aprovação ética do Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital Do Sul e do Serviço de Saúde do Metro South (HREC/07/QPAH/048). Córneas de ovelhas foram obtidas de animais eutanizados no Herston Medical Research Facility da Universidade de Queensland um acordo de compartilhamento de tecidos. 1. Preparação de ferramentas de dissecção Esterilizar dois pares de f?…

Representative Results

O método para isolar e expandir células endoteliais córneas de córneas humanas ou ovelhas é resumido na Figura 1 e Figura 2. A maioria das explantas derivadas das córneas de 1 a 2 anos de idade doadores ou doadores humanos com menos de 30 anos de idade se ligarão às placas de cultura do tecido revestido do Fator anexo dentro de uma semana, no entanto, não é incomum descobrir que até um terço das explantas não se apegam dentro deste período. Essas e…

Discussion

Um desafio técnico significativo associado ao estabelecimento e à expansão das células endoteliais da córnea humana está impedindo que a EMT ocorra nas culturas. A EMT pode ser acionada em células endoteliais da córnea por perda de contato celular-célula, mas a maioria dos protocolos de cultura celular para essas células envolvem dissociação enzimática a células únicas durante o isolamento e subcultura¹⁰. Aqui apresentamos um protocolo alternativo de cultura celular para células en…

Materials

Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.