Рост человеческих и овец Корнель Эндотелиальных клеточных слоев на биоматериальных Мембранах
Summary
Этот протокол описывает критические шаги, необходимые для создания и выращивания золнезовых эндотелиальных клеточных культур из эксплантаторов человеческой или овечьей ткани. Также представлен метод субкультирования эндотелиальных клеток роговицы на мембранных биоматериалах.
Abstract
Корневые эндотелиальные клеточные культуры имеют тенденцию проходить эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (EMT) после потери контакта между клетками и клетками. EMT является вредным для клеток, как это снижает их способность формировать зрелый и функциональный слой. Здесь мы представляем метод для создания и субкультивирования человека и овец роговицы эндотелиальных клеточных культур, что сводит к минимуму потерю контакта от клетки к клетке. Выделяющиеся роговицы эндотелия/мембраны Десцемета взяты из донорской роговицы и помещаются в культуру тканей в условиях, которые позволяют клеткам коллективно мигрировать на поверхность культуры. Как только культура была установлена, explants перенесены к свежим плитам для того чтобы начать новые культуры. Dispase II используется для мягкого подъема скоплений клеток от пластин культуры тканей для субкультирования. Корневые эндотелиальные клеточные культуры, которые были созданы с помощью этого протокола, подходят для передачи в биоматериальные мембраны для производства тканевых клеточных слоев для трансплантации в испытаниях на животных. Описано специальное устройство для поддержки биоматериальных мембран во время культуры тканей и представлен пример тканевого трансплантата, состоящего из слоя эндотелиальных клеток роговицы и слоя стромальных клеток роговицы по обе стороны мембраны коллагена I типа.
Introduction
Роговица представляет собой прозрачную ткань, расположенную в передней части глаза. Он состоит из трех основных слоев: эпителиального слоя на внешней поверхности, среднего строма слой, и внутренний слой называется роговицы эндотелия. Роговицы эндотелия является монослой клеток, который сидит на подвале мембраны называется мембрана Descemet и он поддерживает прозрачность роговицы, регулируя количество жидкости, которая входит в строму из основных вакавный юмор. Слишком много жидкости в стромы вызывает отек роговицы, непрозрачность и потерю зрения. Поэтому эндотелий имеет жизненно важное значение для поддержания зрения.
Эндотелий роговицы может стать дисфункциональным по ряду причин, включая старение, болезни и травмы, и только в настоящее время лечение трансплантации хирургии. Во время этой операции эндотелий и мембрана Десцемета удаляются из роговицы пациента и заменяются трансплантатом эндотелия и мембраны Десцемета, полученной из донорской роговицы. Многие эндотелия трансплантаты также содержат тонкий слой стромальной ткани, чтобы помочь обработки и привязанности к гостю роговицы1.
Во всем мире, спрос на ткани донора роговицы для трансплантации операций больше, чем количество, которое может быть поставлено глаз банков2. Поэтому было стремление к разработке ткани инженерии роговицы эндотелия трансплантации, которые могут быть использованы для облегчения этого дефицита3. Обоснование этого основано на том факте, что в настоящее время эндотелий от отдельной роговицы может быть передан только одному пациенту, однако, если роговицы эндотелиальных клеток были впервые расширены и выращены на биоматериальных лесах в культуре тканей, они могут быть использованы для лечения нескольких пациентов.
Основные проблемы, которые необходимо решить, прежде чем ткани инженерии трансплантации эндотелия роговицы стать возможным вариантом для хирургов включают в себя: (1) создание методов для расширения роговицы эндотелиальных клеток высокого качества и для производства зрелых и функциональные слои эндотелиальных клеток роговицы in vitro, и (2) создание методов для выращивания клеток на биоматериальных эшафотах для производства тканевых трансплантатов, которые равны, или лучше, чем донорские преврены, полученные из роговицы, которые в настоящее время используются.
Корневые эндотелиальные клетки имеют очень низкий пролиферативный потенциал in vivo, но могут быть стимулированы, чтобы разделить in vitro4. Тем не менее, они имеют сильную тенденцию проходить в пробирке эпителиальный к мезенхимальному переходу (EMT), что снижает их способность формировать зрелый, функциональный эндотелиальный слой. Известные триггеры для EMT в эндотелиальных клетках роговицы включают воздействие определенных факторов роста и потерю контакта от клетки к клетке5. Таким образом, почти неизбежно, что культуры эндотелиальных клеток роговицы, которые ферментативно диссоциированы во время субкультуры, претерпит изменения, связанные с EMT. Здесь мы представляем метод клеточной культуры для человека или овец роговицы эндотелиальных клеток, который предназначен для сведения к минимуму нарушения клеток к клетке контактов во время изоляции, расширения и субкультуры этапов, чтобы уменьшить потенциал для EMT. Кроме того, мы демонстрируем, как ткани инженерии трансплантатов, которые напоминают донора роговицы полученных эндотелия / Десцемета мембраны / стромальной ткани трансплантатов может быть произведено путем выращивания культивированных слоев клеток по обе стороны биоматериальной мембраны в специально устройства.
Protocol
Representative Results
Discussion
Значительная техническая проблема, связанная с созданием и расширением эндотелиальных клеток роговицы человека, препятствует возникновению ЭМТ в культурах. EMT может быть вызвано в роговицы эндотелиальных клеток в связи с потерей контакта клетки к клетке, но большинство протоколов кл?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Спасибо Ноэми Галлорини за ее помощь во время подготовки Рисунок 7. Эта работа была поддержана грантом проекта, предоставленным DH Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии (проект Грант 1099922), а также дополнительным финансированием, полученным от Фонда Института глаз Квинсленда.
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
Riferimenti
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
