Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi
Summary
Bu protokol, insan veya koyun dokusu eksbitkilerinden kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve büyümek için gerekli kritik adımları açıklar. Membranöz biyomalzemeler üzerinde kornea endotel hücrelerinin subculturing için bir yöntem de sunulmaktadır.
Abstract
Korneal endotel hücre kültürleri hücre-hücre teması kaybından sonra epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi eğilimi vardır. EMT, olgun ve işlevsel bir tabaka oluşturma yeteneklerini azalttığı için hücreler için zararlıdır. Burada, insan ve koyun kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve subculturing için bir yöntem sunmak hücre-hücre teması kaybını en aza indirir. Kornea endotel/Descemet zarının eksektimi donör kornealardan alınarak hücrelerin kültür yüzeyine topluca göç etmesini sağlayan koşullar altında doku kültürüne yerleştirilir. Bir kültür kurulduktan sonra, eksebitkiler yeni kültürler ilerler. Dispase II hafifçe alt külleme için doku kültürü plakaları kapalı hücrelerin kümeleri kaldırmak için kullanılır. Bu protokol kullanılarak kurulan korneal endotel hücre kültürleri, hayvan deneylerinde transplantasyon için doku mühendisliği hücre tabakaları üretmek için biyomalzeme zarlarına aktarılması için uygundur. Doku kültürü sırasında biyomateryal membranları desteklemek için özel yapım bir cihaz tanımlanmış ve kornea endotel hücrelerinin bir tabaka ve kollajen tip I membran her iki tarafında kornea stromal hücrelerinin bir tabaka oluşan bir doku mühendislik greft bir örnek sunulmaktadır.
Introduction
Kornea gözün önünde bulunan şeffaf bir dokudur. Üç ana tabakadan oluşur: dış yüzeyde bir epitel tabakası, bir orta stroma tabakası, ve kornea endotel denilen bir iç tabaka. Kornea endotel Descemet membran denilen bir bodrum membran üzerinde oturur hücrelerin bir monolayer ve altta yatan sulu mizah stroma girer sıvı miktarını düzenleyerek kornea şeffaflığını korur. Stroma içinde çok fazla sıvı kornea şişmesine neden olur, opaklık ve görme kaybı. Endotel bu nedenle görme korumak için hayati önem taşımaktadır.
Kornea endotel yaşlanma, hastalık ve yaralanma gibi nedenlerle bir dizi için işlevsiz olabilir, ve tek mevcut tedavi nakli ameliyatı. Bu ameliyat sırasında endotel ve Descemet’in zarı hastanın korneasından çıkarılır ve donör korneadan elde edilen endotel ve Descemet membranı grefti ile değiştirilir. Birçok endotel greftleri de taşıma ve ev sahibi kornea1eki yardımcı olmak için stromal doku ince bir tabaka içerir.
Dünya çapında, organ nakli ameliyatları için kornea donör dokusu için talep göz bankaları tarafından temin edilebilir miktardan daha fazladır2. Bu nedenle bu açığı hafifletmek için kullanılabilecek doku mühendisliği kornea endotel nakli geliştirmek için bir sürücü olmuştur3. Bunun gerekçesi şu anda, tek bir korneadan endotel sadece tek bir hastaya transfer edilebilir gerçeğine dayanmaktadır, ancak, kornea endotel hücreleri ilk genişletilmiş ve doku kültüründe biyomalzeme iskeleler üzerinde yetiştirilen ise, birden fazla hasta tedavisinde kullanılabilir.
Doku mühendisliğikorneal endotel nakli cerrahlar için uygun bir seçenek haline gelmeden önce ele alınması gereken başlıca zorluklar şunlardır: (1) yüksek kaliteli kornea endotel hücrelerini genişletmek ve olgun ve üretmek için teknikler kurmak fonksiyonel kornea endotel hücre tabakaları in vitro, ve (2) biyomalzeme iskelelerinde hücreleri büyütmek için teknikler oluşturarak şu anda kullanılan donör kornea kaynaklı greftlere eşit veya daha iyi doku mühendisliği greftler üretmek için.
Korneal endotel hücreleri in vivo çok düşük proliferatif potansiyele sahip ama in vitro bölmek için uyarılabilir4. Yine de, onlar in vitro epitelyal-mezenkimal geçiş geçmesi için güçlü bir eğilim var (EMT), hangi olgun, fonksiyonel endotel tabakası oluşturmak için kapasitelerini azaltır. Kornea endotel hücrelerinde EMT için bilinen tetikleyiciler bazı büyüme faktörleri ve hücre-hücre teması kaybı maruz kalma içerir5. Bu nedenle alt kültür sırasında enzimatik olarak ayrıştırılan kornea endotel hücre kültürlerinin EMT ile ilişkili değişikliklere uğraması neredeyse kaçınılmazdır. Burada, izolasyon, genişleme ve alt kültür aşamalarında hücre-hücre temaslarının bozulmasını en aza indirmek ve EMT potansiyelini azaltmak için tasarlanmış insan veya koyun kornea endotel hücreleri için bir hücre kültürü yöntemi salıyoruz. Ayrıca, donör kornea kaynaklı endotel/Descemet membran/stromal doku greftlerine benzeyen doku yapımı greftlerin, biyomalzeme zarının her iki tarafında ki kültürlü hücre tabakalarının özel yapım bir montaj cihazında nasıl yetiştirilebildiğini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan kornea endotel hücrelerinin kurulması ve genişletilmesi ile ilgili önemli bir teknik sorun emt kültürlerde meydana gelen engelliyor. EMT hücre-hücre teması kaybı ile kornea endotel hücrelerinde tetiklenebilir, ancak bu hücreler için çoğu hücre kültürü protokolleri izolasyon ve altkültür10sırasında tek hücrelere enzimatik dissositasyon içerir. Burada kornea endotel hücreleri için, izolasyon ve alt kültür aşamalarında hücrelerin birbirleriyle teması kaybetme r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Şekil 7hazırlanması sırasında ona yardım için Noémie Gallorini sayesinde . Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (Project Grant 1099922) tarafından DH’ye verilen bir proje hibesi ve Queensland Göz Enstitüsü Vakfı’ndan alınan ek finansman la desteklenmiştir.
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
Riferimenti
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
