Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform
Summary
Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.
Abstract
Patiënt-afgeleide xenografts (PDX), gegenereerd wanneer resected patiënt tumorweefsel rechtstreeks wordt geënt in immuungecompromitteerde muizen, blijven biologisch stabiel, waardoor het behoud van moleculaire, genetische en histologische kenmerken, evenals heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Echter, het gebruik van deze modellen om een veelheid van experimenten uit te voeren, met inbegrip van screening op geneesmiddelen, is onbetaalbaar, zowel in termen van kosten en tijd. Driedimensionale (3D) cultuursystemen worden algemeen gezien als platforms waarin kankercellen hun biologische integriteit behouden door middel van biochemische interacties, morfologie en architectuur. Ons team heeft uitgebreide ervaring met het kweken van PDX cellen in vitro met behulp van 3D matrices bestaande uit hyaluronzuur (HA). Om muisfiblast stromalcellen in verband met PDX’s te scheiden, gebruiken we rotatiecultuur, waarbij stromale cellen zich hechten aan het oppervlak van weefselkweekbehandelde platen terwijl gescheiden PDX-tumorcellen zweven en zichzelf associëren in meercellige clusters. Ook drijvend in de supernatant zijn enkele, vaak dode cellen, die een uitdaging vormen bij het verzamelen van levensvatbare PDX-clusters voor downstream inkapseling in hydrogels voor 3D-celcultuur. Om deze enkele cellen te scheiden van levende celclusters, hebben we dichtheidsstapgradiëntcentrifugatie gebruikt. Het hier beschreven protocol zorgt voor de uitputting van niet-levensvatbare enkele cellen uit de gezonde populatie van celclusters die zullen worden gebruikt voor verdere in vitro experimenten. In onze studies nemen we de 3D-culturen op in microfluïde platen die mediaperfusie tijdens de cultuur mogelijk maken. Na de beoordeling van de resulterende culturen met behulp van een fluorescerende image-based levensvatbaarheidstest van gezuiverde versus niet-gezuiverde cellen, tonen onze resultaten aan dat deze extra scheidingsstap het aantal niet-levensvatbare cellen uit onze culturen aanzienlijk verminderde.
Introduction
In de afgelopen tien jaar heeft het gebied van kankeronderzoek aangetoond hernieuwde enthousiasme voor patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) als een instrument voor de beoordeling van kankercel traject afhankelijkheid en drug gevoeligheid1. De meest voorkomende PDX-modellen worden vastgesteld door onderhuidse of orthotopische implantatie van menselijke tumorcellen – een tumorfragment, een cluster van gescheiden tumorcellen of een monster van geïsoleerde circulerende tumorcellen (CTC’s) -in een knaagdierhost. Als de tumor “nemen” succesvol is, zullen de xenograft cellen zich vermenigvuldigen, vasculariseren en anderszins interageren met het gastheerweefsel om een tumor te creëren, die kan worden geoogst op een optimale grootte, onderverdeeld en opnieuw geïmplanteerd in andere gastheren. Onder hun vele voordelen als modelsysteem behouden PDX’s doorgaans een aanzienlijk deel van de heterogeniteit van de inheemse tumorcelpopulatie en maken het de beoordeling van mensspecifieke trajecten en celreactiesmogelijk 2,3. De in vivo context maakt tumorinteractie met vasculatuur en andere aangrenzende stroma mogelijk en recapituleert weefselkenmerken zoals drugsdiffusiedynamiek, zuurstofspanning en extracellulaire matrix die de progressie van de tumor biologisch en mechanisch beïnvloeden. Een negatief aspect van PDXs is hun afhankelijkheid van een knaagdier gastheer, zowel voor tumor expansie en uiteindelijk voor hypothese testen. Omdat veel PDX’s zich niet kunnen aanpassen aan de traditionele tweedimensionale (2D)-cultuur op weefselkweek polystyreen zonder veel van hun wenselijke kenmerken te verliezen, is er een minimale middenweg voor onderzoekers tussen deze relatief gecontroleerde in vitro-methode en de aanzienlijke toename van de kosten, faciliteiten en tijdsvereisten voor in vivo PDX-gebruik.
We hebben meerdere in vitro modellen beschreven die 3D-celcultuur implementeren binnen een ondersteunende matrix, en onlangs uitgebreid dat werk aan te tonen de ex vivo cultuur van meervoudige prostaatkanker (PCa)-afgeleide PDX’s, zowel alleen als in co-cultuur met beenmerg-afgeleide fibroblasten4,5. Hyaluronzuur (HA)-gebaseerde hydrogelmatrices bieden aanpasbare en biologisch relevante ondersteuning voor beide celtypen, met facile controle over hydrogelkenmerken en optische helderheid voor beeldvorming door de hydrogeldiepte6.
Volwassen PDX tumorweefsels bestaan uit een variabel mengsel van heterogene menselijke kankercellen en muisstroma (fibroblasten, endotheelcellen, enz.). Om cel-type specifieke bijdragen aan tumorprogressie in vitro te bestuderen, kan het voordelig zijn om tumoren te scheiden, de celpopulaties te scheiden en experimenteel op een georganiseerde manier op te nemen om trajecten van intercellulaire communicatie te ontleden. De gemengde celpopulaties in weefselvertgates hebben differentiële compatibiliteit met specifieke kweekomstandigheden. Bijvoorbeeld, tumor-geassocieerde fibroblast levensvatbaarheid vereist ofwel oppervlak aanhankelijkheid of 3D matrices gefunctionaliseerd met integrin liganden, terwijl epitheel-afgeleide PDX cellen hebben meestal niet deze eisen, in plaats daarvan ten gunste van celcel interacties. Deze verschillen kunnen worden benut om een effectieve scheiding van PDX-cellen van besmettende muisstromalcellen te bereiken. Rotatiecultuur van weefselvert verteert maakt stromale celtrouw aan het weefselkweekoppervlak mogelijk, terwijl celcelverklevingen PDX-cellen drijven die boven het roterende kweekoppervlak zweven om meercellige clusters in het supernatant te vormen in 24−48 uur. De specifieke kenmerken van deze clusters variëren met de PDX (bijvoorbeeld grote, strakke, zeer bolvormige clusters of kleinere, lossere aggregaten die lijken op trossen druiven), maar zijn meestal van biologisch relevante afmetingen (50−250 μm diameter), voldoende voor het beoordelen van cellulaire interacties die afhankelijk zijn van intercellulaire contacten.
Tumor retrieval en verwerking onvermijdelijk resulteert in een zekere mate van collateral cell dood, hetzij als gevolg van schade op korte termijn van mechanische / enzymatische verstoring, of op lange termijn onverenigbaarheid van subpopulaties met de gekozen cultuur voorwaarden. Ondanks het nut van rotatiecultuur als eerste bulkscheiding, worden dode of stervende cellen onvermijdelijk overgebracht met de PDX clusters en kunnen de resulterende cultuur beïnvloeden. Deze dode cellen zijn vaak individuele PDX cellen die niet werden geïntegreerd in een cluster, muis stromale fibroblasten die niet kunnen overleven in geselecteerde cultuuromstandigheden, of bijzonder fragiele endotheelcellen. Dergelijke stervende cellen kunnen experimentele resultaten van “overlevenden” beïnvloeden en kunnen een aanzienlijke invloed hebben op kwantificering, bijvoorbeeld via fluorescerende op beelden gebaseerde screeningtesten op basis van beeld. Om de selectie van levende PDX-cellen uit deze methode te verbeteren, hebben we centrifugatiemethoden aangepast met dichtheidsstappen om individuele dode/stervende cellen gemakkelijk te verwijderen uit PDX-mengsels en overwegend levende meercellige clusters te behouden.
Om de studie van resulterende PDX-afgeleide clusters in de 3D-cultuur te verbeteren, hebben we gebruik gemaakt van een microfluidics-gebaseerde perfusiecultuurplatform, de OrganoPlate (figuur 1), een hoog-doorvoerorgaan-op-een-chip-platform dat simultane cultuur van maximaal 96 individuele perfusie, 3D-culturen op een 384-wellitert microbordbasis (Figuur 1A)7,8. In de 2-baans microfluidic plaat wordt een enkele weefselchip verbonden door twee microfluïde kanalen (Figuur 1B, gelkanaal: rood, perfusiekanaal: blauw) die vier putten op een rij omspannen. De twee microfluidic kanalen worden gescheiden door een korte plastic nok genaamd een Phaseguide die overloop van een kanaal in zijn aangrenzende buurman kanaal voorkomt, en tegelijkertijd zorgt voor een membraan-vrije interface tussen de inhoud van de gel en perfusie kanaal9. Omdat de bodem van de microfluidic plaat bestaat uit microfluïde glas, kunnen de culturen in het observatievenster via de bodem van de plaat worden bekeken met een standaard of geautomatiseerde microscoop. Perfusie is gevestigd in de microfluïde plaat met een programmeerbare rocker, met behulp van de zwaartekracht om media te rijden door de microfluïde kanalen, tussen reservoirputten (Figuur 1C). De perfusie stroom-nabootst meer samenvatten de tumor micromilieu dan statische cultuur, waardoor voor de integratie van schuifspanning en verbeterde distributie van gassen en voedingsstoffen. De voordelen van het behoud van een geperfundeerde kankercelcultuur in de microfluïde plaat zijn eerder beschreven als geperfundeerde borstkankerculturen die een optimale levensvatbaarheid vertoonden in vergelijking met een statische 3D-cultuur van dezelfde cellen7.
Het onderhavige rapport beschrijft een aangepaste dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode voor het isoleren van levende meercellige PDX-clusters en toont zijn nut bij het vestigen van 3D PDX-culturen binnen perfusable microfluïde platen. Omdat een toenemend aantal onderzoekslaboratoria methoden zoekt om het gebruik van PDX te vergemakkelijken, verwachten we dat de hier gepresenteerde protocollen van onmiddellijke nut zullen zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een methode voor het verwerken en kweken van levensvatbare PDX-afgeleide tumorcellen in een hoge doorvoer, geperfuseerd 3D-kweeksysteem. Hoewel dit protocol pca PDX-weefsel gebruikt, is het even effectief voor andere epitheliale tumoren. Tumorkenmerken variëren tussen individuele PDX-lijnen, zelfs binnen hetzelfde weefsel van oorsprong (prostaat, borst, enz.). Sommige PCa PDX lijnen zijn meer fibrotische en moeilijk te isoleren levensvatbare cellen uit, terwijl anderen zijn meer cellulaire. De tumor …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Fase I (HHSN26120700015C) en P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
Riferimenti
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Ricerca sul cancro. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
