Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력
Summary
이 프로토콜은 환자 유래 제노이식(PDX)의 시험관 내 배양을 확장가능하게 하는 방법을 보여 줍니다. 한 단계는 실행 불가능한 단일 셀을 간단하게 제거하여 3D 하이드로겔에서 다세포 클러스터 배양의 전반적인 생존력을 향상시킵니다. 보조 단계는 PERfused 된 미세 유체 플랫폼에서 PDX 문화에 대한 모범 사례를 보여줍니다.
Abstract
환자 유래 이종이이식(PDX)은 환자 종양 조직이 면역 손상 된 마우스로 직접 이식 될 때 생성되며 생물학적으로 안정적으로 유지되어 분자, 유전 및 조직학적 특징뿐만 아니라 원래 종양의 이질성을 보존합니다. 그러나, 약물 스크리닝을 포함한 수많은 실험을 수행하기 위해 이러한 모델을 사용하는 것은 비용과 시간 면에서 모두 금지된다. 3차원(3D) 배양 시스템은 암세포가 생화학적 상호 작용, 형태학 및 건축을 통해 생물학적 무결성을 유지하는 플랫폼으로 널리 간주됩니다. 우리 팀은 히알루론산 (HA)으로 구성된 3D 행렬을 사용하여 시험관 내에서 PDX 세포를 배양한 광범위한 경험을 가지고 있습니다. PDX와 관련된 마우스 섬유아세포 기질 세포를 분리하기 위해, 우리는 기질 세포가 조직 배양 판의 표면에 부착되는 회전 배양을 사용하며 PDX 종양 세포가 부유하고 다세포 클러스터로 자체 연관시합니다. 또한 상체에 떠있는 것은 3D 세포 배양을 위한 하이드로겔로 다운스트림 캡슐화를 위한 실행 가능한 PDX 클러스터를 수집하는 데 어려움을 제시하는 단일, 종종 죽은 세포입니다. 이러한 단일 세포를 라이브 셀 클러스터에서 분리하기 위해 밀도 단계 그라데이션 원심 분리를 채택했습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 추가 시험관 내 실험을 위해 사용될 세포 클러스터의 건강한 집단에서 실행 불가능한 단세포의 고갈을 허용합니다. 우리의 연구에서, 우리는 문화 동안 미디어 관류를 허용하는 미세 유체 판에 3D 배양을 통합합니다. 정제되지 않은 세포와 정제된 세포의 형광 이미지 기반 생존 가능성 분석기를 사용하여 결과 배양을 평가한 결과, 우리의 결과는 이 추가 분리 단계가 우리의 배양에서 실행 불가능한 세포의 수를 실질적으로 감소시켰다는 것을 보여줍니다.
Introduction
지난 10년 동안 암 연구 분야는 암세포 통로 의존도 및 약물 감수성1을평가하기 위한 도구로 환자 유래 제노이식(PDXs)에 대한 새로운 열정을 입증해 왔다. 가장 일반적인 PDX 모델은 인간 종양 세포의 피하 또는 직교 이식에 의해 확립됩니다 – 종양 단편, 해리 된 종양 유래 세포의 클러스터, 또는 절연 순환 종양 세포의 샘플 (CTC)-설치류 숙주로. 종양 “테이크”가 성공하면, 이종이이식 세포가 증식, 혈관화 및 그렇지 않으면 최적의 크기로 수확될 수 있는 종양을 만들기 위해 숙주 조직과 상호 작용하여 다른 호스트로 다시 이식될 수 있습니다. 모델 시스템으로서 이들의 많은 장점 중에서, PDX는 전형적으로 네이티브 종양 세포 집단의 이질성의 상당 부분을 유지하고 인간 특이적 경로 및 세포 반응2,,3의평가를 가능하게 한다. 생체 내 컨텍스트는 혈관 및 기타 인접 성 기질과의 종양 상호 작용을 가능하게하고 생물학적 및 기계적으로 종양 진행에 영향을 미치는 약물 확산 역학, 산소 장력 및 세포 외 매트릭스 영향과 같은 조직 특성을 재구성합니다. PDXs의 부정적인 측면은 종양 확장을 위한 설치류 호스트에 대한 의존과 궁극적으로 가설 검사를 위한 것입니다. 많은 PDX는 바람직한 특성을 많이 잃지 않고 조직 배양 폴리스티렌에 대한 전통적인 2차원 (2D) 문화에 적응할 수 없기 때문에, 상대적으로 조절된 체외 방법 과 생체 내 PDX 사용에 대한 비용, 시설 및 시간 요구 사항의 상당한 증가 사이에 연구자에게 최소한의 중간 지점이 있었습니다.
우리는 지원 매트릭스 내에서 3D 세포 배양을 구현하는 여러 체외 모델을 설명하고, 최근에는 골수 유래섬유아세포4,,5와함께 단독으로 그리고 공동 배양에서 다중 전립선암(PCa)유래 PDX의 전 생체 배양을 입증하기 위해 그 작업을 확장하였다. 히알루론산(HA)기반 하이드로겔 매트릭스는 하이드로겔 깊이6을통한 이미징을 위한 하이드로겔 특성및 광학 선명도에 대한 촉진제어와 함께 두 세포 유형에 대해 사용자 정의 가능하고 생물학적으로 관련된 지원을 제공한다.
성숙한 PDX 종양 조직은 이질적인 인간 암세포 및 마우스 기질 (섬유아세포, 내피 세포 등)의 가변 혼합물을 포함한다. 체외에서 종양 진행에 대한 세포 형 특이적 기여를 연구하기 위해 종양을 해리하고 세포 집단을 분리하며 세포 간 통신의 경로를 해부하는 조직된 방식으로 실험적으로 통합하는 것이 유리할 수 있습니다. 조직 발굴내의 혼합 세포 인구는 특정 배양 조건과의 차동 적 호환성을 갖는다. 예를 들어, 종양 관련 섬유아세포 생존가능성은 인테그린 리간드로 기능화된 표면 준수 또는 3D 행렬을 필요로 하며, 상피 유래 PDX 세포는 전형적으로 이러한 요구 사항을 갖지 않고 세포 세포 상호 작용을 선호합니다. 이러한 차이는 마우스 기질 세포를 오염에서 PDX 세포의 효과적인 분리를 달성하기 위해 악용 될 수있다. 조직 발굴의 회전 배양은 세포-세포 접착이 24-48h에서 상체체에 다세포 클러스터를 형성하기 위해 회전 배양 표면 위에 떠 있는 PDX 세포를 구동하는 동안 조직 배양 표면에 기질 세포 부착을 허용합니다. 이러한 클러스터의 특정 특성은 PDX(예: 크고, 단단하고, 구형군이 많거나, 포도 무리를 닮은 더 작고, 느슨한 골재)와 다르지만, 일반적으로 생물학적으로 관련된 크기(50-250 μm 직경)에 따라 세포 간 접촉에 의존하는 세포 상호 작용을 평가하기에 충분합니다.
종양 검색 및 처리는 필연적으로 기계적 / 효소 중단으로 인한 단기 손상 또는 선택한 문화 조건과의 하위 집단의 장기적인 비호환성으로 인해 어느 정도의 부수적 인 세포 사멸을 초래합니다. 초기 벌크 분리로서 회전 배양의 유용성에도 불구하고, 죽거나 죽어가는 세포는 필연적으로 PDX 클러스터로 전송되고 결과 배양에 영향을 미칠 수 있다. 이 죽은 세포는 수시로 클러스터, 선택된 배양 조건에서 살아남을 수 없는 마우스 기질 섬유아세포, 또는 특히 연약한 내피 세포에 통합되지 않은 개별 PDX 세포입니다. 이러한 죽어가는 세포는 “생존자”의 실험 결과에 영향을 미칠 수 있으며 형광 이미지 기반 생존 가능성 스크리닝 을 통해 정량화에 실질적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 이 방법에서 살아있는 PDX 세포의 선택을 개선하기 위해, 우리는 PDX 혼합물에서 개별 죽은 / 죽어가는 세포를 쉽게 제거하고 주로 살아있는 다세포 클러스터를 유지하기 위해 밀도 단계와 원심 분리 방법을 적응.
3D 배양에서 PDX 유래 클러스터의 연구를 강화하기 위해, 우리는 384 웰 마이크로티터 플레이트에 최대 96 개의 개별, 3D 배양의 동시 배양을 허용하는 높은 처리량 오르간 온 – 칩 플랫폼인 미세 유체 기반 관류 배양7플랫폼인OrganoPlate(그림1)를활용했습니다. 2차선 미세유체 플레이트에서 단일 티슈 칩은 2개의 미세유체채널(도 1B,젤 채널: 빨강, 관류 채널: 블루)에 의해 연결됩니다. 두 개의 미세 유체 채널은 한 채널의 인접 한 채널의 오버플로를 방지하는 Phaseguide라는 짧은 플라스틱 능선으로 분리되며 동시에 젤과 관류 채널9의내용 사이의 막 없는 인터페이스를 허용합니다. 미세 유체 판의 바닥은 현미경 등급 유리로 구성되기 때문에, 배양은 표준 또는 자동화 된 현미경으로 플레이트의 바닥을 통해 관찰 창에서 볼 수 있습니다. 관류는 프로그래밍 가능한 로커가 있는 미세유체 판에 설치되어 중력을 사용하여 미세유체 채널을 통해 미디어를 구동하며, 저수지우물(도 1C)을통해 미디어를 구동한다. 관류 흐름 모방은 정적 배양보다 종양 미세 환경을 더 밀접하게 재구성하여 전단 응력의 통합과 가스와 영양소의 향상된 분포를 허용합니다. 미세유체판에서 관융합된 암 세포 배양을 유지하는 이점은 이전에 동일한 세포의 정적 3D 배양에 비해 최적의 생존가능성을 나타내는 것으로 설명되어 있다7.
본 보고서는 라이브 다세포 PDX 클러스터를 격리하기 위한 적응된 밀도 그라데이션 원심분리 방법을 설명하고, 구불구형 미세 유체 플레이트 내에서 3D PDX 배양을 확립하는 데 있어 유용성을 입증합니다. PDX 사용을 용이하게 하는 방법을 모색하는 연구 실험실의 수가 늘어나고 있기 때문에 여기에 제시된 프로토콜이 즉각적인 유용성일 것으로 예상됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 높은 처리량, perfused 3D 배양 시스템에서 실행 가능한 PDX 유래 종양 세포를 처리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 PCa PDX 조직을 활용하는 동안, 다른 상피 유래 종양에 대해 동등하게 효과적입니다. 종양 특성은 동일한 기원 조직(전립선, 유방 등)내에서도 개별 PDX 대사마다 다릅니다. 일부 PCa PDX 라인은 다른 사람들이 더 세포 인 동안 에서 실행 가능한 세포를 격리하기 어?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 국립 암 연구소 SBIR 단계 I의 국립 연구소에 의해 지원되었다 (HHSN26120700015C) 및 P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
Riferimenti
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Ricerca sul cancro. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
