Улучшенная жизнеспособность для Ex vivo 3D гидрогелевых культур ксенотрансплантатов, полученных пациентами, в переливной микрофлюидной платформе
Summary
Этот протокол демонстрирует методы, позволяющие расширенную культуру in vitro ксенотрансплантатов пациентов (PDX). Один из шагов повышает общую жизнеспособность многоклеточных кластерных культур в 3D гидрогелях, путем прямого удаления не жизнеспособных одиночных клеток. Вторичный шаг демонстрирует лучшие практики для культуры PDX в перфлитированных микрофлюидных платформ.
Abstract
Ксенотрансплантаты пациентов (PDX), генерируемые при ресектировании опухолевой ткани пациента, присвякаются непосредственно в иммунокомпромиссных мышей, остаются биологически стабильными, тем самым сохраняя молекулярные, генетические и гистологические особенности, а также неоднородность первоначальной опухоли. Однако использование этих моделей для проведения множества экспериментов, включая скрининг на наркотики, является непомерно высоким как с точки зрения затрат, так и с точки зрения времени. Трехмерные (3D) системы культуры широко рассматриваются как платформы, в которых раковые клетки сохраняют свою биологическую целостность посредством биохимических взаимодействий, морфологии и архитектуры. Наша команда имеет большой опыт культивирования клеток PDX in vitro с использованием 3D матриц, состоящих из гиалуроновой кислоты (HA). Для того, чтобы отделить мышь фибробластов стромальных клеток, связанных с PDXs, мы используем культуру вращения, где стромальные клетки придерживаются поверхности ткани культуры обработанных пластин в то время как диссоциированные клетки опухоли PDX плавать и самостоятельно ассоциировать в многоклеточных кластеров. Кроме того, плавающие в supernatant являются одними, часто мертвые клетки, которые представляют собой проблему в сборе жизнеспособных кластеров PDX для инкапсуляции вниз по течению в гидрогели для 3D-клеточной культуры. Для того, чтобы отделить эти одиночные клетки от живых клеточных кластеров, мы использовали градиентную центрифугирование плотности. Описанный здесь протокол допускает истощение не жизнеспособных одиночных клеток из здоровой популяции клеточных кластеров, которые будут использоваться для дальнейших экспериментов в пробирке. В наших исследованиях мы включаем 3D-культуры в микрофлюидные пластины, которые позволяют перфузии средств массовой информации во время культуры. После оценки результатных культур с использованием флуоресцентного изображения на основе анализа жизнеспособности очищенных по сравнению с неочищенные клетки, наши результаты показывают, что этот дополнительный шаг разделения существенно сократили число нежизнеспособных клеток из наших культур.
Introduction
За последнее десятилетие, область исследований рака продемонстрировала новый энтузиазм для пациентов, полученных ксенотрансплантатов (PDXs) в качестве инструмента для оценки рака клеток пути опоры и лекарственнойвосприимчивости 1. Наиболее распространенные модели PDX устанавливаются подкожной или ортопедической имплантацией опухолевых клеток человека – фрагментом опухоли, скоплением диссоциированных опухолевых клеток или образцом изолированных циркулирующих опухолевых клеток (КТК) — в хозяина грызунов. Если опухоль “взять” успешно, ксенотрансплантат клетки будут размножаться, васкуляризации, и в противном случае взаимодействовать с принимающей ткани для создания опухоли, которые могут быть собраны при оптимальном размере, подразделяется, и повторно имплантированы в других хозяев. Среди их многочисленных преимуществ в качестве модели системы, PDXs обычно сохраняют значительную часть неоднородности популяции опухолевых клеток и позволяют оценить человека конкретных путей и клеточныхреакций 2,3. Контекст in vivo позволяет взаимодействие опухоли с сосудами и другими смежными стромами и резюмирует характеристики тканей, такие как динамика диффузии наркотиков, кислородное напряжение и внеклеточное матричное влияние, которое биологически и механически влияет на прогрессирование опухоли. Негативным аспектом PDX является их зависимость от грызунов хозяина, как для расширения опухоли и в конечном итоге для тестирования гипотез. Поскольку многие PDX не могут адаптироваться к традиционной двумерной (2D) культуре тканей полистирола, не теряя при этом многих из своих желательных характеристик, существует минимальная середина для исследователей между этим относительно контролируемым методом in vitro, и значительным увеличением расходов, средств и требований времени для использования in vivo PDX.
Мы описали несколько моделей in vitro, которые реализуют культуру 3D клеток в рамках поддерживающей матрицы, а недавно расширили эту работу, чтобы продемонстрировать культуру ex vivo множественного рака простаты (PCa) полученных PDXs, как в одиночку, так и в совместной культуре с костным мозгом полученныхфибробластов 4,5. Гиалуроновая кислота (HA) на основе гидрогеля матрицы обеспечивают настраиваемую и биологически релевантную поддержку для обоих типов клеток, с поверхностным контролем над характеристиками гидрогеля и оптической ясности для визуализации через гидрогельглубины 6.
Зрелые опухолевые ткани PDX состоят из переменной смеси неоднородных раковых клеток человека и стромы мыши (фибробласты, эндотелиальные клетки и т.д.). Для изучения клеточного типа конкретных вкладов в прогрессирование опухоли в пробирке, это может быть выгодно, чтобы отделить опухоли, отделить популяции клеток, и экспериментально включить их в организованном порядке, чтобы вскрыть пути межклеточной связи. Смешанные популяции клеток в тканях дигестатов имеют дифференциальную совместимость с конкретными культурными условиями. Например, связанная с опухолью фибробластная жизнеспособность требует либо поверхностного присоединения, либо 3D матриц, функционируют с лигандами интегрина, в то время как эпителиальные клетки PDX обычно не имеют этих требований, вместо этого отдающих предпочтение взаимодействиям клеток и клеток. Эти различия могут быть использованы для достижения эффективного отделения клеток PDX от загрязняющих мыши стромальных клеток. Культура вращения тканей дигеста позволяет стромальной клеточной приверженности поверхности культуры тканей в то время как клеточные спайки диск PDX клетки, плавающие над вращающейся поверхностью культуры, чтобы сформировать многоклеточные кластеры в супернатант в 24-48 ч. Специфические характеристики этих скоплений варьируются в зависимости от PDX (например, большие, плотные, высокосферические кластеры или меньшие, более свободные агрегаты, напоминающие гроздь винограда), но, как правило, имеют биологически релевантные размеры (диаметр 50–250 мкм), достаточные для оценки клеточных взаимодействий, которые опираются на межклеточные контакты.
Поиск и обработка опухолей неизбежно приводит к определенной степени сопутствующей гибели клеток либо из-за кратковременного повреждения в результате механических/энзиматических нарушений, либо к длительной несовместимости субпопуляций с выбранными культурными условиями. Несмотря на полезность культуры вращения как первоначального массового разделения, мертвые или умирающие клетки неизбежно передаются с кластерами PDX и могут влиять на связанную с этим культуру. Эти мертвые клетки часто являются отдельными клетками PDX, которые не были интегрированы в кластер, мыши стромальные фибробласты, которые не могут выжить в определенных условиях культуры, или особенно хрупкие эндотелиальные клетки. Такие умирающие клетки могут влиять на экспериментальные результаты “выживших” и могут существенно влиять на количественную оценку, например, с помощью анализов флуоресцентного скрининга жизнеспособности на основе изображений. Чтобы улучшить выбор живых клеток PDX из этого метода, мы адаптировали методы центрифугации с шагами плотности, чтобы легко удалить отдельные мертвые/умирающие клетки из смесей PDX и сохранить преимущественно живые многоклеточные кластеры.
Для повышения изучения результатов PDX полученных кластеров в 3D-культуре, мы использовали микрофлюиды основе перфузии культуры платформы, OrganoPlate (Рисунок 1), который является высокой пропускной способностью орган-на-чипе платформы, которая позволяет для одновременной культуры до 96 отдельных проникнуты, 3D культур на 384-ну микротитер пластины базы (,Рисунок 1A)7.8 В 2-полосной микрофлюидной пластине один чип ткани соединен двумя микрофлюидными каналами(рисунок 1B,гель-канал: красный, перфузионый канал: синий), которые охватывают четыре скважины подряд. Два микрофлюидных канала разделены коротким пластиковым хребтом под названием Phaseguide, который предотвращает переполнение одного канала в соседний соседний канал, и одновременно позволяет без мембраны интерфейс между содержимым геля и перфузииканала 9. Поскольку дно микрофлюидной пластины состоит из микроскопического стекла, культуры можно рассматривать в окне наблюдения через дно пластины со стандартным или автоматизированным микроскопом. Перфузия устанавливается в микрофлюидной пластине с программируемой рокер, используя гравитацию для привода средств массовой информации через микрофлюидные каналы, междускважинами резервуара (рисунок 1C). Перфузионный поток-мимикрирует более тесно recapitulates микроокноронности опухоли, чем статическая культура, что позволяет для включения стресса стрижки и расширение распределения газов и питательных веществ. Преимущества поддержания перфлитой культуры раковых клеток в микрофлюидной пластине ранее были описаны как переплетаются культуры рака молочной железы выставлены оптимальной жизнеспособности по сравнению со статической 3D-культуры тех жеклеток 7.
В настоящем докладе описывается адаптированный метод центрифугирования плотности для изоляции живых многоклеточных кластеров PDX и демонстрируется его полезность в создании 3D культур PDX в пределах перфузируемых микрофлюидных пластин. Поскольку все большее число исследовательских лабораторий ищут методы для облегчения использования PDX, мы ожидаем, что представленные здесь протоколы будут иметь непосредственную полезность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем метод обработки и культивирования жизнеспособных опухолевых клеток, полученных PDX, в высокой пропускной способности, пролитой 3D-культуре. Хотя этот протокол использует PCa PDX ткани, он одинаково эффективен для других эпителиальных полученных опухолей. Характеристики …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Национального института рака SBIR Фаза I (HHSN26120700015C) и P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
Riferimenti
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Ricerca sul cancro. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
