Y-27632 enrichit le rendement des mélanocytes humains à partir de tissus cutanés adultes
Summary
Cet article rapporte que l’ajout de Y-27632 à TIVA moyen peut augmenter considérablement le rendement des mélanocytes des tissus de la peau adulte.
Abstract
L’isolement et la culture des mélanocytes primaires des tissus cutanés sont très importants pour la recherche biologique et ont été largement utilisés pour des applications cliniques. Isoler les mélanocytes primaires des tissus cutanés par la méthode conventionnelle prend habituellement environ 3 à 4 semaines pour passer suffisamment. Plus important encore, les tissus utilisés sont généralement des avant-parents nouveau-nés et il est encore un défi d’isoler efficacement les mélanocytes primaires des tissus adultes. Nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode d’isolement pour les mélanocytes qui ajoute Y-27632, un inhibiteur de la rhénase, au milieu de culture initial pendant 48 h. Par rapport au protocole conventionnel, cette nouvelle méthode augmente considérablement le rendement des mélanocytes et raccourcit le temps nécessaire pour isoler les mélanocytes des tissus de prépuce. Nous décrivons maintenant cette nouvelle méthode plus en détail en utilisant l’épiderme adulte pour la culture efficace des mélanocytes primaires. Fait important, nous montrons que les mélanocytes obtenus à partir de tissus adultes préparés par cette nouvelle méthode peuvent fonctionner normalement. Ce nouveau protocole bénéficiera de manière significative aux études des défauts de pigmentation et des mélanomes utilisant des mélanocytes primaires préparés à partir de tissus de peau adultes facilement accessibles.
Introduction
Le but de cette étude était de développer un protocole simple et efficace pour isoler les mélanocytes de l’épiderme de la peau adulte pour la recherche biologique et les applications cliniques. Les mélanocytes, qui sont situés dans l’épiderme basal de la peau et dans les follicules pileux, jouent un rôle important dans la pigmentation de la peau et des cheveux en produisant de la mélanine1. La pigmentation cutanée résultante des mélanocytes épidermiques agit comme un filtre de rayonnement ultraviolet qui réduit /empêche les dommages d’ADN aux cellules sous-jacentes dans la peau2. La prolifération anormale des mélanocytes dans la peau est assez commune, comme dans la formation de nevi bénin (taupes) dans lequel les mélanocytes potentiellement se transformer en croissance oncogène suivie par la sénescence cellulaire3.
Depuis 1957, l’isolement et la culture subséquente des mélanocytes primaires humains est possible4, mais ce n’est que depuis 1982 qu’il existe une méthode efficace qui peut reproduire les cultures de mélanocytes humains à partir de l’épiderme5. La méthode conventionnelle pour isoler les mélanocytes primaires de l’épiderme implique une digestion enzymatique en deux étapes. En bref, la peau est d’abord digérée avec du dispase pour séparer l’épiderme du derme, après quoi l’épiderme est digéré avec de la trypsine pour produire des suspensions contenant des mélanocytes et des kératinocytes, qui peuvent ensuite être cultivées sélectivement dans différents médias. Actuellement, la culture initiale prend habituellement environ 3 à 4 semaines pour que les mélanocytes atteignent la confluence en utilisant la méthode conventionnelle, qui est probablement due à la faible efficacité de leur isolement. Par conséquent, l’augmentation de la production initiale de mélanocytes à partir de tissus de la peau adulte serait très utile pour la recherche en laboratoire et les applications cliniques.
De nombreux facteurs de croissance, dont la plupart ont été sécrétés par les kératinocytes (p. ex., α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF et SCF)5à8, régulent la différenciation et la prolifération des mélanocytes mammifères. En l’absence de couches d’alimentation, l’absence de ces facteurs de croissance conduit à la diminution de la prolifération des mélanocytes et leur apoptose accrue9. La co-culture des kératinocytes comme cellules d’alimentation et de mélanocytes pourrait conduire à la prolifération accélérée des mélanocytes et à la réduction de l’apoptose. Cependant, la méthode de co-culture exige non seulement plus de tissus de peau pour préparer des kératinocytes, ce qui n’est pas pratique, mais aussi ne pourrait pas fonctionner efficacement parce que les conditions de culture exigées par les mélanocytes ne favorise pas la croissance des kératinocytes, et vice-versa.
Des études antérieures ont rapporté que l’ajout de Y-27632, un inhibiteur de ROCK, dans le milieu de croissance peut améliorer le rendement des cellules épidermiques primaires humaines des tissus de la peau10–14. Par conséquent, il serait intéressant de vérifier si l’isolement des mélanocytes primaires humains bénéficierait de la présence de Y-27632. En effet, l’ajout de Y-27632 dans le milieu15de tiva d’inoculation , qui contient TPA, IBMX, Na3VO4 et dbcAMP, a considérablement augmenté le rendement des mélanocytes primaires isolés des tissus de prépuce dans les cultures initiales16. Par rapport au protocole conventionnel, ce nouveau protocole est nettement plus efficace pour augmenter le rendement des mélanocytes16. Par conséquent, ce protocole décrit la nouvelle méthode en détail à l’aide de tissus cutanés adultes basés sur une étude précédente16 afin de promouvoir son application dans la recherche biologique de base et appliquée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici était basé sur une publication récente16. Une certaine attention devrait être accordée aux étapes critiques suivantes pour obtenir les meilleurs résultats avec la nouvelle méthode. Tout d’abord, la séparation réussie de l’épiderme et du derme est cruciale. Couper les tissus du prépuce adulte en bandes de 3 à 4 mm de large à l’aide d’une lame de scalpel pour que le dispase fonctionne plus soigneusement et plus facilement pour séparer l’épiderme du …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), the Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD3 et the Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) à X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) et The Funds Funds Funds of Shandong University (2019GN043) à J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
Riferimenti
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