Y-27632 성인 피부 조직에서 인간 멜라닌 세포의 수율을 강화
Summary
이 논문은 TIVA 배지에 Y-27632를 첨가하면 성인 피부 조직에서 멜라닌세포의 수율을 크게 증가시킬 수 있다고 보고합니다.
Abstract
피부 조직에서 1 차적인 멜라닌세포의 격리 그리고 문화는 생물학 연구를 위해 아주 중요하고 임상 응용을 위해 널리 이용되고 있습니다. 종래의 방법에 의한 피부 조직으로부터 1차 멜라닌세포를 분리하는 데는 보통 충분히 통과하기까지 약 3~4주가 소요된다. 더 중요한 것은, 사용된 조직은 일반적으로 신생아 포킨스이고 성인 조직에서 1 차적인 melanocytes를 효율적으로 격리하는 도전입니다. 최근에는 Rho 키나아제 억제제인 Y-27632를 초기 배양 배지에 48h.를 추가하는 멜라닌세포에 대한 새로운 절연 방법을 개발했습니다. 우리는 지금 1 차적인 melanocytes를 능통하게 배양하기 위하여 성인 표피를 사용하여 더 자세히 이 새로운 방법을 기술합니다. 중요한 것은, 우리는 이 새로운 방법에 의해 제조된 성인 조직에서 얻은 멜라닌세포가 정상적으로 작동할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이 새로운 프로토콜은 쉽게 접근 성인 피부 조직에서 제조된 1 차적인 흑색종을 사용하여 색소 침착 결함 및 흑색종의 연구 결과를 현저하게 유익할 것입니다.
Introduction
이 연구의 목표는 생물학적 연구 및 임상 응용을 위해 성인 피부표에서 멜라닌신을 분리하는 간단하고 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 피부의 기저 표피와 모낭에 위치한 멜라닌 세포는 멜라닌1을생성하여 피부와 모발의 색소 침착에 중요한 역할을 한다. 표피 멜라닌세포로부터의 피부 색소 침착은 피부2의근본적인 세포에 DNA 손상을 줄여 방지하는 자외선 필터역할을 한다. 피부에 있는 멜라닌세포의 비정상적인 증식은 멜라닌세포가 잠재적으로 세포 노화3에선행된 종양발생 성장으로 잠재적으로 변환되는 양성 네비(moles)의 형성과 같이 아주 일반적이다.
1957년 이래, 인간 1차 멜라닌세포의 고립및 후속 배양은4가가능했지만, 1982년부터만 표피5로부터인간의 멜라닌세포의 배양을 재현가능하게 확립할 수 있는 효율적인 방법이 있었다. 표피로부터 1차 멜라닌세포를 분리하는 종래의 방법은 2단계 효소 소화를 포함한다. 간단히 말해서, 피부는 처음에 진피에서 표피를 분리하기 위해 디스파스로 소화되며, 그 후 표피는 트립신으로 소화되어 멜라노세포와 각질 세포가 함유된 현탁액을 생성하며, 이는 다른 미디어에서 선택적으로 재배될 수 있다. 현재, 초기 배양은 일반적으로 멜라닌세포가 기존의 방법을 사용하여 합류에 도달하는 데 약 3~4주가 걸리며, 이는 그들의 격리효율이 낮기 때문일 가능성이 높다. 따라서 성인 피부 조직에서 멜라닌 세포의 초기 생산을 증가 실험실 연구 및 임상 응용 모두에 대 한 매우 도움이 될 것 이다.
많은 성장 인자, 대부분은 각질 세포에 의해 분비되는 것으로 나타났다 (예를 들어, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF 및 SCF)5–8,포유류 멜라노사이클의 분화 및 확산을 조절. 피더 층이 없는 경우, 이러한 성장 인자의 부족은 멜라닌세포의 증식 감소와 세포멸 감소9로이어집니다. 피더 세포와 멜라닌세포로 각질 세포의 공동 배양은 멜라닌세포 증식을 가속화하고 세포멸을 감소시킬 수 있다. 그러나, 공동 배양 방법은 실용적이지 않은 각질 세포를 준비하기 위해 더 많은 피부 조직을 요구할 뿐만 아니라 멜라노세포에 요구되는 배양 조건이 각질 세포 성장을 선호하지 않기 때문에 효율적으로 작동할 수 없으며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
이전 연구는 Y-27632의 추가, ROCK 억제제, 성장 배지에 피부 조직에서 인간의 일차 표피 세포의 수율을 향상시킬 수 있다고 보고10–14. 따라서, 인간 1 차적인 멜라닌세포의 격리가 Y-27632의 존재에서 유익할 지 여부를 시험하는 것이 흥미로할 것입니다. 실제로, Y-27632를 접종 TIVA배지(15)에첨가하여 TPA, IBMX, Na3VO4 및 dbcAMP를 함유하고 있으며, 초기 배양에서 포피 조직으로부터 분리된 1차 멜라닌세포의 수율을 크게증가시켰다(16). 종래의 프로토콜에 비해, 이 새로운 프로토콜은멜라닌세포(16)의수율을 높이는 데 훨씬 더 효율적입니다. 따라서, 본 프로토콜은 기초및 적용된 생물학적 연구에서 적용을 촉진하기 위해 이전 연구16을 기반으로 성인 피부 조직을 사용하여 새로운 방법을 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 최근 간행물16을기반으로 했습니다. 새로운 방법으로 최상의 결과를 얻으려면 다음 중요한 단계에 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 표피와 진피의 성공적인 분리가 중요합니다. 성인 포피 조직을 메스 블레이드를 사용하여 3-4mm 너비의 스트립으로 잘라 내어 디스파가 더 철저하고 쉽게 변미에서 표피를 분리할 수 있도록 합니다. 둘째, 이 두 층을 분리할…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2017YFA0104604), 중국 국립 자연 과학 재단의 일반 프로그램 (81772093), 군사 물류 연구 프로젝트 (AWS17J005), 산동성 자연 과학 재단 (ZR2019ZD33)의 주요 프로그램에 의해 지원되었습니다. 6) 산동성 의 주요 연구 개발 프로그램 (2019GSF108107) X.W. 광동 기본 및 응용 기본 연구 재단 (2019A1515110833) 및 산동대학의 기초 연구 기금 (2019GN043)에 J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
Riferimenti
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