Y-27632 enriquece el rendimiento de los melanocitos humanos de los tejidos adultos de la piel
Summary
Este documento informa que la adición de Y-27632 al medio TIVA puede aumentar significativamente el rendimiento de los melanocitos de los tejidos cutáneos adultos.
Abstract
El aislamiento y cultivo de melanocitos primarios de los tejidos de la piel es muy importante para la investigación biológica y ha sido ampliamente utilizado para aplicaciones clínicas. Aislar los melanocitos primarios de los tejidos de la piel por el método convencional generalmente toma alrededor de 3 a 4 semanas para pasar lo suficiente. Más importante aún, los tejidos utilizados son generalmente prepucios recién nacidos y sigue siendo un desafío aislar eficientemente los melanocitos primarios de los tejidos adultos. Recientemente desarrollamos un nuevo método de aislamiento para melanocitos que añade Y-27632, un inhibidor de la quinasa Rho, al medio de cultivo inicial durante 48 h. En comparación con el protocolo convencional, este nuevo método aumenta dramáticamente el rendimiento de los melanocitos y acorta el tiempo necesario para aislar los melanocitos de los tejidos de prepucio. Ahora describimos este nuevo método con más detalle utilizando la epidermis adulta para cultivar eficientemente melanocitos primarios. Es importante destacar que los melanocitos obtenidos a partir de tejidos adultos preparados por este nuevo método pueden funcionar normalmente. Este nuevo protocolo beneficiará significativamente los estudios de defectos de pigmentación y melanomas utilizando melanocitos primarios preparados a partir de tejidos de piel adultos de fácil acceso.
Introduction
El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo simple y eficaz para aislar los melanocitos de la epidermis de la piel adulta para la investigación biológica y aplicaciones clínicas. Los melanocitos, que se encuentran en la epidermis basal de la piel y en los folículos pilosos, desempeñan un papel importante en la pigmentación de la piel y el cabello produciendo melanina1. La pigmentación cutánea resultante de los melanocitos epidérmicos actúa como un filtro de radiación ultravioleta que reduce/previene el daño del ADN a las células subyacentes en la piel2. La proliferación anormal de melanocitos en la piel es bastante común, como en la formación de nevi benignos (moles) en los que los melanocitos potencialmente se transforman en crecimiento oncogénico seguido de la senescencia celular3.
Desde 1957, el aislamiento y posterior cultura de los melanocitos primarios humanos ha sido posible4, pero sólo desde 1982 ha habido un método eficiente que puede establecer reproduciblemente culturas de melanocitos humanos de la epidermis5. El método convencional para aislar los melanocitos primarios de la epidermis implica una digestión enzimática de dos pasos. Brevemente, la piel se digiere inicialmente con dispase para separar la epidermis de la dermis, después de lo cual la epidermis se digiere con tripina para producir suspensiones que contienen melanocitos y queratinocitos, que luego pueden ser cultivados selectivamente en diferentes medios. Actualmente, el cultivo inicial suele tardar entre 3 y 4 semanas en llegar a la confluencia utilizando el método convencional, que es probable que se deba a la baja eficiencia de su aislamiento. Por lo tanto, aumentar la producción inicial de melanocitos a partir de tejidos cutáneos adultos sería muy útil tanto para la investigación de laboratorio como para aplicaciones clínicas.
Muchos factores de crecimiento, la mayoría de los cuales han demostrado ser secretados por queratinocitos (p. ej., -MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF y SCF)5–8, regulan la diferenciación y proliferación de melanocitos de mamíferos. En ausencia de capas alimentadoras, la falta de esos factores de crecimiento conduce a la disminución de la proliferación de melanocitos y su aumento de la apoptosis9. El co-cultivo de queratinocitos como células alimentadas y melanocitos podría conducir a la proliferación acelerada de melanocitos y a reducir la apoptosis. Sin embargo, el método de co-cultivo no sólo exige más tejidos de la piel para preparar queratinocitos, lo que no es práctico, sino que también no podría funcionar eficientemente porque las condiciones de cultivo requeridas por los melanocitos no favorecen el crecimiento de queratinocitos, y viceversa.
Estudios previos han informado de que la adición de Y-27632, un inhibidor de ROCK, en el medio de crecimiento puede mejorar el rendimiento de las células epidérmicas primarias humanas de los tejidos de la piel10–14. Por lo tanto, sería interesante probar si el aislamiento de los melanocitos primarios humanos se beneficiaría de la presencia de Y-27632. De hecho, la adición de Y-27632 en el medio TIVA de inoculación15, que contiene TPA, IBMX, Na3VO4 y dbcAMP, aumentó significativamente el rendimiento de los melanocitos primarios aislados de los tejidos de prepucio en los cultivos iniciales16. En comparación con el protocolo convencional, este nuevo protocolo es significativamente más eficiente en el aumento del rendimiento de los melanocitos16. Por lo tanto, este protocolo describe el nuevo método en detalle utilizando tejidos cutáneos adultos basados en un estudio anterior16 con el fin de promover su aplicación en la investigación biológica básica y aplicada.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí se basó en una publicación reciente16. Se debe prestar cierta atención a los siguientes pasos críticos para lograr los mejores resultados con el nuevo método. En primer lugar, la separación exitosa de la epidermis y la dermis es crucial. Corte los tejidos adultos del prepucio en tiras de 3-4 mm de ancho usando una cuchilla de bisturí para hacer que el dispase funcione más a fondo y fácilmente para separar la epidermis de la dermis. En segundo lugar, al separar …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0104604), el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772093), Proyecto de Investigación Logística Militar (AWS17J005), el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2019ZD36) y el Programa clave de investigación y desarrollo de la provincia de Shandong (2019GSF108107) a X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) y The Fundamental Research Funds of Shandong University (2019GN043) a J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
Riferimenti
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