Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos
Summary
Este artigo relata que a adição de Y-27632 ao meio TIVA pode aumentar significativamente o rendimento de melanócitos de tecidos de pele adultos.
Abstract
O isolamento e a cultura dos melanócitos primários dos tecidos da pele é muito importante para a pesquisa biológica e tem sido amplamente utilizado para aplicações clínicas. Isolar melanócitos primários dos tecidos da pele pelo método convencional geralmente leva cerca de 3 a 4 semanas para passar o suficiente. Mais importante, os tecidos utilizados geralmente são prepúcios recém-nascidos e ainda é um desafio isolar eficientemente os melanócitos primários de tecidos adultos. Recentemente desenvolvemos um novo método de isolamento para melanócitos que adiciona Y-27632, um inibidor de Rho quinase, ao meio de cultura inicial por 48 h. Em comparação com o protocolo convencional, este novo método aumenta drasticamente o rendimento dos melanócitos e encurta o tempo necessário para isolar melanócitos de tecidos foreskin. Descrevemos agora este novo método com mais detalhes usando epiderme adulta para cultivar de forma eficiente melanócitos primários. É importante ressaltar que os melanócitos obtidos a partir de tecidos adultos preparados por este novo método podem funcionar normalmente. Este novo protocolo beneficiará significativamente os estudos de defeitos de pigmentação e melanomas usando melanócitos primários preparados a partir de tecidos de pele adultos de fácil acesso.
Introduction
O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo simples e eficaz para isolar melanócitos da epiderme da pele adulta para pesquisa biológica e aplicações clínicas. Os melanócitos, localizados na epiderme basal da pele e nos folículos capilares, desempenham um papel importante na pigmentação da pele e do cabelo, produzindo melanina1. A pigmentação da pele resultante dos melanócitos epidérmicos atua como um filtro de radiação ultravioleta que reduz/previne danos ao DNA às células subjacentes na pele2. A proliferação anormal de melanócitos na pele é bastante comum, como na formação de nevi benigno (mols) em que os melanócitos potencialmente se transformam em crescimento oncogênico seguido pela senescência celular3.
Desde 1957, o isolamento e a cultura subsequente dos melanócitos primários humanos são possíveis4, mas somente desde 1982 existe um método eficiente que pode estabelecer de forma reproduzivelmente culturas de melanócitos humanos a partir da epiderme5. O método convencional para isolar melanócitos primários da epiderme envolve uma digestão enzimática de duas etapas. Resumidamente, a pele é inicialmente digerida com despase para separar a epiderme da derme, após a qual a epiderme é digerida com trippsina para produzir suspensões contendo melanócitos e queratinócitos, que podem então ser cultivados seletivamente em diferentes mídias. Atualmente, a cultura inicial geralmente leva cerca de 3 a 4 semanas para que os melanócitos atinjam a confluência usando o método convencional, o que é provável devido à baixa eficiência de seu isolamento. Portanto, aumentar a produção inicial de melanócitos a partir de tecidos de pele adultos seria bastante útil tanto para pesquisas laboratoriais quanto para aplicações clínicas.
Muitos fatores de crescimento, a maioria dos quais têm se mostrado secretados por queratinócitos (por exemplo, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF e SCF)5–8, regulam a diferenciação e proliferação de melanócitos mamíferos. Na ausência de camadas alimentadores, a falta desses fatores de crescimento leva à diminuição da proliferação de melanócitos e ao aumento da apoptose9. A co-cultura dos queratinócitos como células alimentadoras e melanócitos poderia levar à acelerada proliferação de melanócitos e à redução da apoptose. No entanto, o método de cocultura não só exige mais tecidos da pele para preparar queratinócitos, o que não é prático, mas também não poderia funcionar de forma eficiente porque as condições culturais exigidas pelos melanócitos não favorecem o crescimento do queratinócito, e vice-versa.
Estudos anteriores relataram que a adição do Y-27632, um inibidor de ROCHA, no meio de crescimento pode aumentar o rendimento das células epidérmicas primárias humanas dos tecidos da pele10–14. Portanto, seria interessante testar se o isolamento dos melanócitos primários humanos beneficiaria da presença de Y-27632. De fato, a adição de Y-27632 no meio TIVA de inoculação15, que contém TPA, IBMX, Na3VO4 e dbcAMP, aumentou significativamente o rendimento de melanócitos primários isolados dos tecidos prepúcios nas culturas iniciais16. Em comparação com o protocolo convencional, este novo protocolo é significativamente mais eficiente no aumento do rendimento dos melanócitos16. Portanto, este protocolo descreve o novo método em detalhes utilizando tecidos de pele adultos com base em um estudo anterior16, a fim de promover sua aplicação em pesquisas biológicas básicas e aplicadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui foi baseado em uma publicação recente16. Alguma atenção deve ser dada aos seguintes passos críticos para alcançar os melhores resultados com o novo método. Em primeiro lugar, a separação bem sucedida da epiderme e da derme é crucial. Corte os tecidos de prepúcio adulto em tiras de 3-4 mm de largura usando uma lâmina de bisturi para fazer o dispase funcionar com mais profundidade e facilidade para separar a epiderme da derme. Em segundo lugar, ao separar essas …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2017YFA0104604), O Programa Geral da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81772093), Projeto de Pesquisa Logística Militar (AWS17J005), o Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (ZR2019ZD36) e o Programa de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da Província de Shandong (2019GSF108107) para x.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A151510833) e Os Fundos Fundamentais de Pesquisa da Universidade de Shandong (2019GN043) para J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
Riferimenti
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