Presentato qui è un protocollo per l'infezione da Pseudomonas aeruginosa e l'applicazione della terapia del fago negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica (CF).
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Applicazione di terapia del fago per contrastare l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica
In questo articolo
Sommario
Abstract
La resistenza antimicrobica, una delle principali conseguenze dell'incertezza diagnostica e della sovraprescrizione antimicrobica, è una causa sempre più riconosciuta di infezioni gravi, complicazioni e mortalità in tutto il mondo con un enorme impatto sulla nostra società e sul sistema sanitario. In particolare, i pazienti con sistema immunitario compromesso o patologie preesistenze e croniche, come la fibrosi cistica (CF), sono sottoposti a frequenti trattamenti antibiotici per controllare le infezioni con l'aspetto e la diffusione di isolati multifarmacologici resistenti. Pertanto, vi è l'urgente necessità di affrontare terapie alternative per contrastare le infezioni batteriche. L'uso di batteriofagi, i nemici naturali dei batteri, può essere una possibile soluzione. Il protocollo dettagliato in questo lavoro descrive l'applicazione della terapia del fago contro l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish CF. Gli embrioni di zebrafish sono stati infettati da P. aeruginosa per dimostrare che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa in quanto riduce la letalità, il peso batterico e la risposta immunitaria pro-infiammatoria negli embrioni CF.
Introduzione
La terapia del fago, l'uso dei nemici naturali dei batteri per combattere le infezioni batteriche, sta raccogliendo rinnovato interesse man mano che la resistenza batterica agli antibiotici diventadiffusa 1,,2. Questa terapia, utilizzata da decenni nell'Europa orientale, potrebbe essere considerata un trattamento complementare agli antibiotici nella cura delle infezioni polmonari nei pazienti con CF e una possibile alternativa terapeutica per i pazienti infetti da batteri resistenti a tutti gli antibiotici attualmente in uso2,,3. I vantaggi della terap....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I pesci zebra adulti (Danio rerio) del ceppo AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) sono mantenuti secondo le linee guida internazionali (Direttiva UE 2010/63/UE) e nazionali (decreto italiano 4marzo 2014, n. 26) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Le condizioni standard sono fissate nell'impianto ittico con un ciclo di buio di 14 ore /10 h e una temperatura dell'acqua del serbatoio a 28 °C.
1. Preparazione di soluzioni e strumenti
- Preparare una soluzione stock 50x e 1x soluzioni di lavoro per il mezzo embrionale E3 per la coltivazione di embrioni di zebrafish (vedi tabel....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I risultati e le cifre qui presentati sono riferiti agli embrioni di CF generati attraverso l'iniezione di cftr morpholinos come descritto inprecedenza 10 e nella fase 5. Per convalidare il fenotipo CF, è stata presa in considerazione la posizione compromessa di organi interni come cuore, fegato e pancreas come descritto in precedenza17 (Figura 1). Risultati analoghi sono stati ottenuti nel caso degli embrioni WT, come riportato nella .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo manoscritto, abbiamo descritto il protocollo per eseguire l'infezione da P. aeruginosa (PAO1) negli embrioni di zebrafish e come applicare la terapia del fago con un cocktail di fagi precedentemente identificati come in grado di infettare PAO1 per risolverlo. L'uso di batteriofagi come alternativa ai trattamenti antibiotici è stato di crescente interesse dagli ultimi anni. Ciò è dovuto principalmente alla diffusione di infezioni batteriche multi-resistenti ai farmaci (MDR), che costituiscono un grave p.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Etile 3-amminobenzoato metansolfonato | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | nome comune tricaina |
| Micromanipolatore Femtojet | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/marrone P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarosio | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Agarosio a basso punto di fusione | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Solfato di magnesio | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Blu | metilicoSigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Aghi per microiniezione | Apparecchio | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Strumenti | progettati dal ricercatore | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Soluzione di rosso fenolo | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronasi | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Reagente ACS cloruro di sodio, ≥ 99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscopio | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Triptone | Ossoide | LP0042B | |
| Estratto di lievito | Ossoide | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microiniezione | Word Strumenti di |
Riferimenti
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
