Applicazione di terapia del fago per contrastare l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica
Summary
Presentato qui è un protocollo per l’infezione da Pseudomonas aeruginosa e l’applicazione della terapia del fago negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica (CF).
Abstract
La resistenza antimicrobica, una delle principali conseguenze dell’incertezza diagnostica e della sovraprescrizione antimicrobica, è una causa sempre più riconosciuta di infezioni gravi, complicazioni e mortalità in tutto il mondo con un enorme impatto sulla nostra società e sul sistema sanitario. In particolare, i pazienti con sistema immunitario compromesso o patologie preesistenze e croniche, come la fibrosi cistica (CF), sono sottoposti a frequenti trattamenti antibiotici per controllare le infezioni con l’aspetto e la diffusione di isolati multifarmacologici resistenti. Pertanto, vi è l’urgente necessità di affrontare terapie alternative per contrastare le infezioni batteriche. L’uso di batteriofagi, i nemici naturali dei batteri, può essere una possibile soluzione. Il protocollo dettagliato in questo lavoro descrive l’applicazione della terapia del fago contro l’infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish CF. Gli embrioni di zebrafish sono stati infettati da P. aeruginosa per dimostrare che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa in quanto riduce la letalità, il peso batterico e la risposta immunitaria pro-infiammatoria negli embrioni CF.
Introduction
La terapia del fago, l’uso dei nemici naturali dei batteri per combattere le infezioni batteriche, sta raccogliendo rinnovato interesse man mano che la resistenza batterica agli antibiotici diventadiffusa 1,,2. Questa terapia, utilizzata da decenni nell’Europa orientale, potrebbe essere considerata un trattamento complementare agli antibiotici nella cura delle infezioni polmonari nei pazienti con CF e una possibile alternativa terapeutica per i pazienti infetti da batteri resistenti a tutti gli antibiotici attualmente in uso2,,3. I vantaggi della terapia antibiotica sono che i batteriofagi si moltiplicano nel sito di infezione, mentre gli antibiotici vengono metabolizzati ed eliminati dalcorpo 4,5. In effetti, la somministrazione di cocktail di fagi virulenti isolati in diversi laboratori si è dimostrata efficace nel trattare le infezioni da Pseudomonas aeruginosa in modelli animali diversi come insetti e mammiferi6,,7,,8. La terapia del fago ha anche dimostrato di essere in grado di ridurre il carico batterico nelle ferite da ustione infettate da P. aeruginosa ed Escherichia coli in uno studio clinico randomizzato9.
Zebrafish (Danio rerio) è recentemente emerso come un modello prezioso per studiare le infezioni con diversi agenti patogeni, tra cui P. aeruginosa10,,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia12,,13. Microiniettando batteri direttamente nella circolazione sanguignadell’embrione 14 è facile stabilire un’infezione sistemica che viene contrastata dal sistema immunitario innato zebrafish, che è evolutivo conservato con neutrofili e generazione di macrofagi simile alla controparte umana. Inoltre, durante il primo mese di vita, gli embrioni di zebrafish mancano della risposta immunitaria adattiva, rendendoli modelli ideali per studiare l’immunità innata, che è il meccanismo di difesa critico nelle infezioni polmonariumane 15. Zebrafish è recentemente emerso come un potente sistema di modelli genetici per comprendere meglio l’insorgenza della CF e sviluppare nuovi trattamentifarmacologici 10,,16,,17. Il modello cf zebrafish di cftr knock-down generato con iniezione di morfolino nel pesce zebra ha presentato una risposta di scoppio respiratorio smorzato e una ridotta migrazione neutrofila10, mentre il knock-out cftr porta a una posizione interna dell’organo compromessa e alla distruzione del pancreas esocrina, un fenotipo che rispecchia la malattia umana16,,17. Di maggiore interesse è stato il risultato che il carico batterico P. aeruginosa è stato significativamente più elevato negli embrioni cftr-perdita di funzione che nei controlli a 8 ore dopo l’infezione (hpi), che è parallelo ai risultati ottenuti con topi e cellule epiteliali bronchialiumane 2,18.
In questo lavoro, dimostriamo che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa negli embrioni di zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, abbiamo descritto il protocollo per eseguire l’infezione da P. aeruginosa (PAO1) negli embrioni di zebrafish e come applicare la terapia del fago con un cocktail di fagi precedentemente identificati come in grado di infettare PAO1 per risolverlo. L’uso di batteriofagi come alternativa ai trattamenti antibiotici è stato di crescente interesse dagli ultimi anni. Ciò è dovuto principalmente alla diffusione di infezioni batteriche multi-resistenti ai farmaci (MDR), che costituiscono un grav…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (FFC#22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
Riferimenti
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Biologia dello sviluppo. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
