嚢胞性線維症ゼブラフィッシュ胚における シュードモナス緑膿症 感染に対抗するためのファージ療法アプリケーション
Summary
ここで提示されるシュー ドモナス緑膿菌 感染およびファージ療法の嚢胞性線維症(CF)ゼブラフィッシュ胚における適用のためのプロトコルです。
Abstract
抗菌性は、診断の不確実性と抗菌過剰処方の主要な結果であり、私たちの社会と健康システムに大きな影響を与える世界的な重篤な感染症、合併症、および死亡率のますます認識された原因です。特に、嚢胞性線維症(CF)などの免疫系または既存および慢性病理が損なわれた患者は、多剤耐性分離株の出現および拡散による感染を制御するために頻繁に抗生物質治療を受ける。したがって、細菌感染に対抗するための代替療法に取り組む緊急の必要性がある。バクテリオファージの使用は、細菌の天敵であり、可能な解決策であり得る。本研究で詳述されるプロトコルは、CFゼブラフィッシュ胚における緑膿菌感染に対するファージ療法の適用について説明する。ゼブラフィッシュ胚は、CF胚の致死性、細菌負担および炎症促進免疫応答を減少させるので、ファージ療法がP.緑素症感染に対して有効であることを実証するためにP.緑素吸素症に感染した。
Introduction
ファージ療法は、細菌感染と戦うために細菌の天敵を使用して、抗生物質に対する細菌耐性が広がり、1,2,2となるように新たな関心を集めている。この治療法は、東ヨーロッパで何十年も使用され、CF患者における肺感染症を治癒する抗生物質に対する補完的な治療法と、現在使用されているすべての抗生物質22,33に耐性のある細菌に感染した患者に対する可能な治療代替手段と考えることができる。抗生物質療法の利点は、バクテリオファージが感染部位で増殖するのに対し、抗生物質は代謝され、体内44、55から排除される。実際、異なる実験室で分離された毒性のあるファージのカクテルの投与は、動物モデルにおけるシュードモナス緑膿菌感染症を、昆虫や哺乳類6、7、87,8と異なるように治療するのに有効であることが証明されている。ファージ療法は、P.緑頭症および大腸菌に感染した火傷の細菌負担を無作為化臨床試験9で軽減できることも示した。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、最近、P.緑膿菌10、11、マイコバクテリウム膿瘍および11ブルカンディア・セパシア1212、1313を含むいくつかの病原体の感染症を研究するための貴重なモデルとして浮上している。細菌を直接胚血液循環14にマイクロ注入することにより、ヒトと同様に好中球およびマクロファージ生成で進化的に保存されるゼブラフィッシュ自然免疫系によって打ち消される全身感染を確立することが容易である。さらに、生後1ヶ月の間に、ゼブラフィッシュ胚は適応免疫応答を欠き、ヒト肺感染症15における重要な防御機構である先天免疫を研究するための理想的なモデルとなる。ゼブラフィッシュは最近、CFの発症をよりよく理解し、新しい薬理学的治療法10、16、1716,17を開発するための強力な遺伝モデルシステムとして登場しました。10ゼブラフィッシュのモルフォリノ注射で発生したcftrノックダウンのCFゼブラフィッシュモデルは、湿った呼吸バースト応答を提示し、好中球移動を減少させた10を呈し、cftrノックアウトは内臓位置の障害および外分泌膵臓の破壊につながり、ヒト疾患16、17,17を反映する表現型である。最も興味深かったのは、P.緑素座細菌の負担が、マウスおよびヒト気管支上皮細胞22,1818で得られた結果と平行する感染後8時間の対照(hpi)よりもcftr-機能喪失胚において有意に高いという発見であった。
本研究では、ゼブラフィッシュ胚の P.緑素吸入症 に対してファージ療法が有効であることを実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、ゼブラフィッシュ胚における P.緑素吸 葉(PAO1)感染を行うプロトコルと、それを解決するためにPAO1に感染しうると以前に同定されたファージのカクテルでファージ療法を適用する方法について述べた。抗生物質治療の代替としてバクテリオファージを使用することは、ここ数年から関心が高まっています。これは主に多剤耐性(MDR)細菌感染の拡散によるもので、公衆衛生上の…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、イタリア嚢胞性線維症財団(FFC#22/2017)によって支援されました。アソシアツィオーネ “グリ・アミチ・デッラ・リッティ” カスニゴと FFC#23/2019;ピウ・オンルス・ラ・マノ・テサ・オンルスのウン・レスピロ)。
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
Riferimenti
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Biologia dello sviluppo. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
