Mikroskopische Beobachtung der Lymphozytendynamik in Rat Peyers Patches
Summary
Hier beschreiben wir eine präzise Methode zum Sammeln von Thoraxkanallymphozyten und zur Beobachtung der Migration von darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-Peyer-Pflastern für 3 Stunden mit Zeitrafferfotografie. Diese Technik kann klären, wie die Dynamik von Lymphozyten unter entzündlichen Bedingungen beeinflusst wird.
Abstract
Naive Lymphozyten zirkulieren unter physiologischem Zustand aus dem Blut in das Lymphgewebe und es wird allgemein als ein wichtiges Phänomen in der Darmimmunität anerkannt. Die Stroma von sekundären Lymphorganen, wie Peyers Pflaster (PPs) oder mesenterischen Lymphknoten, sind, wo naive Lymphozyten Antigene spüren. Naive Lymphozyten zirkulieren durch den Blutkreislauf, um hohe endotheliale Venules zu erreichen, das Portal des Eintritts in PPs. Es wird geschätzt, dass einige Immunmodulatoren die Lymphozytenmigration beeinflussen, aber die genaue Bewertung der Mikrozirkulationsdynamik ist sehr schwierig, und die Festlegung einer Methode zur Beobachtung der Lymphozytenmigration in vivo kann zur Klärung der genauen Mechanismen beitragen. Wir verfeinerten die Methode, Lymphozyten aus dem Lymphkanal zu sammeln und die detaillierte Dynamik von Darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-PPs zu beobachten. Wir haben uns für die konfokale Laserscanmikroskopie entschieden, um Ratten-PPs in vivo zu beobachten und sie mit Zeitrafferfotografie aufzuzeichnen. Wir können jetzt klare Bilder erhalten, die zur Analyse der Lymphozytendynamik beitragen können.
Introduction
Peyers Pflaster (PPs) bestehen aus Hunderten von Lymphfollikel in der Lamina propria des Dünndarms. PPs sind in Follikel, die interfollikuläre Region und Keimzentren im unteren Teil der Follikel unterteilt, wo Lymphozyten durch Antigen-Präsentation stimuliert werden. Es gibt keine afferenten Lymphgefäße, und die Antigene dringen über die Epithelzellschicht aus dem Darmlumen in die Lamina propria ein. Die epitheliale Region, die Lymphfollikel bedeckt, wird follikelassoziiertes Epithel genannt, in dem spezialisierte interspersierte M-Zellen Schleimhautantigene aufnehmen. M-Zellen nehmen Antigene von der luminalen Seite auf und Antigene werden dann von dendritischen Zellen eingefangen und in Richtung naiver Lymphozyten präsentiert, die durch das Endothel von hohen endothelialen Venulen (HEVs)diPPs fließen. PPs spielen eine wichtige Rolle bei der Darmimmunität und sind mit dem frühen Stadium der Entzündung verbunden. Viele molekulare Wechselwirkungen beinhalten den Eintritt von Lymphozyten zu sekundären Lymphorganen (SLOs), einschließlich Adhäsionsmoleküle, Chemokine2,3und Sphingosin-1-Phosphat4; Daher gibt es viele erwartete therapeutische Ziele. Daher ermöglicht die Beobachtung der Lymphozytendynamik innerhalb von PPs, einen Einblick in das sehr frühe Stadium der Entzündung zu erhaschen und die Nützlichkeit mehrerer vielversprechender Medikamente zu untersuchen.
Die Methode konzentriert sich hier auf die Migration von Lymphozyten in PPs, die mehrere Verfahren umfasst (Kannulation in den Brustkanal5 und Das Sammeln von Lymphozyten und Langzeitbeobachtung nach der Injektion in gesammelte Lymphozyten). Da diese Verfahren komplex sind und es schwierig war, genau zu sehen, wie jedes Verfahren in früheren Berichten durchgeführt wurde, haben wir hier einige Tipps erwähnt, um eine erfolgreiche Beobachtung zu erreichen. Zum Beispiel war die Cannulation der Rohre in den Brustkanal sehr schwierig, und die anfängliche Erfolgsrate der Cannulation betrug weniger als 50%. Wir haben die Methode jedoch verbessert und eine Erfolgsquote von über 80 % erzielt. Wir haben einige weitere Tipps in diesem Manuskript erwähnt, die für die erfolgreiche Beobachtung notwendig sind, um die quantitative Auswertung der transendotheliale Migration von Lymphozyten unter verschiedenen Bedingungen zu ermöglichen.
In früheren Berichten war es schwierig, die dreidimensionalen Veränderungen im Laufe der Zeit zu verstehen, wie die intravenöse Injektion von Indientinte, um die Gefäßstruktur von PPs6zu färben, oder das Mikroskop ist monofokal7. In den letzten Jahren hat eine Beobachtungsmethode mit einigen photoconvertiblefluoreszenzproteintransgenen Tieren wie Kaede-Mäusen systematische zelluläre Bewegungen in vivo8geklärt. Die andere Studie verdeutlichte CD69 unabhängige Abschaltung von Lymphozyten austritt aus PPs9. Wir verwendeten konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) wegen seiner hohen Analysefähigkeit. Jetzt können wir leicht hochauflösende Bilder erhalten und sie verwenden, um die Lymphozytendynamik zu analysieren.
In diesem Bericht haben wir eine Reihe von Methoden zur Bewertung der Lymphozytenmigration in PPs demonstriert. Zuerst zeigten wir raffinierte Methoden der thorakalen Kanalkannulation, um Lymphozyten zu sammeln. Zweitens haben wir die Beobachtungsmethoden auf verschiedene Weise verbessert, um objektive Organe nach Möglichkeit unter mikroskopischer Beobachtung zu erhalten, so dass wir 3 Stunden lang qualitativ hochwertige Bilder erhalten können. Drittens quantifizierten wir die zellulären Bewegungen der Lymphozytenmigration, um die Auswirkungen einiger Medikamente zu bewerten. Diese geänderten Protokolle werden zur Entwicklung von Mukosal-Immunologie-Evaluierungen beitragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben wir ein Protokoll zum Sammeln naiver Darm-Tropen-Lymphozyten und zur Beobachtung ihrer Migration in Ratten-PPs. Diese Verfahren können zeigen, wie sich Lymphozyten in der Mikrovaskulatur von PPs bewegen und es ermöglichen, ihre Dynamik unter einem normalen oder medikamentösen Zustand visuell zu vergleichen. Die direkte Beobachtung dieser Dynamik hat viel Verdienst, einen Hinweis auf eine immunologische Veränderung durch einige Medikamente zu erhalten, obwohl der Beobachtungszeitraum auf wenige Stunde…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Stipendien des National Defense Medical College und durch ein Forschungsstipendium für Gesundheits- und Arbeitswissenschaften für die Erforschung hartnäckiger Krankheiten vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt, Japan, unterstützt.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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