Микроскопическое наблюдение за динамикой лимфоцитов в патчах Крысы Пейера
Summary
Здесь мы описываем точный метод сбора лимфоцитов грудного протока и наблюдения за миграцией кишечных лимфоцитов в патчах крысы Пейера в течение 3 часов с помощью замедленной фотографии. Этот метод может прояснить, как динамика лимфоцитов страдают при воспалительных условиях.
Abstract
Наивные лимфоциты рециркуляции из крови в лимфоидные ткани в физиологическом состоянии, и это обычно признается в качестве важного явления в кишечнике иммунитета. Строма вторичных лимфоидных органов, таких как патчи Пейера (PPs) или мезентерические лимфатические узлы, где наивные лимфоциты смысле антигенов. Наивные лимфоциты циркулируют через кровоток, чтобы достичь высоких эндотелиальных венул, портал входа в PPs. Некоторые иммуномодуляторы, по оценкам, влияют на миграцию лимфоцитов, но точная оценка динамики микроциркуляции очень сложна, и создание метода наблюдения за миграцией лимфоцитов in vivo может способствовать уточнению точных механизмов. Мы усовершенствовали метод сбора лимфоцитов из лимфатического протока и наблюдения за детальной динамикой кишечных лимфоцитов в крысиных PPs. Мы выбрали конфокалиптальный лазерного сканирования микроскопии для наблюдения крыс PPs in vivo и записал его с помощью замедленной фотографии. Теперь мы можем получить четкие изображения, которые могут способствовать анализу динамики лимфоцитов.
Introduction
Патчи Пейера (PPs) состоят из сотен лимфоидных фолликулов в ламина проприя тонкой кишки. PPs разделены на фолликулы, межфолликулярной области, и зародышевых центров, расположенных в нижней части фолликулов, где лимфоциты стимулируются антиген презентации. Есть нет афферентных лимфатических сосудов, и антигены вторгаются в ламина проприя из кишечного люмена через эпителиальный слой клеток. Эпителиальная область, покрывающая лимфоидные фолликулы, называется связанный с фолликулом эпителий, в рамках которого специализированные перемежаются M-клетки поглощения слизистых антигенов. M клетки принимают в антигены с люминесцентной стороны и антигены затем захвачены дендритных клеток и представлены к наивным лимфоцитов, которые входят в PPs через эндотелий высоких эндотелиальных венул (HEVs)1. PPs играют важную роль в кишечном иммунитете и связаны с ранней стадией воспаления. Многие молекулярные взаимодействия включают вход лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы (СЛО), включая молекулы адгезии,хемокины 2,3и сфингозин-1-фосфат4; таким образом, существует много ожидаемых терапевтических целей. Таким образом, наблюдение за динамикой лимфоцитов в PPs позволяет нам мельком увидеть очень раннюю стадию воспаления и изучить полезность нескольких перспективных препаратов.
Метод здесь фокусируется на миграции лимфоцитов в PPs, которая включает в себя несколько процедур (каннуляция в груднойпроток 5 и сбор лимфоцитов и долгосрочное наблюдение после инъекции в собранные лимфоциты). Поскольку эти процедуры являются сложными и было трудно понять, как именно каждая процедура была выполнена в предыдущих докладах, мы упомянули здесь несколько советов для достижения успешного наблюдения. Например, канюляция труб в грудной проток была очень трудной, а первоначальный показатель успеха канюляции был менее 50%. Тем не менее, мы усовершенствовали метод и достигли успеха, превышающего 80%. Мы упомянули некоторые другие советы в этой рукописи, которые необходимы для успешного наблюдения, чтобы дать количественную оценку трансендотелиальной миграции лимфоцитов при нескольких условиях.
В предыдущих докладах, было трудно понять трехмерные изменения с течением времени, такие как внутривенные инъекции чернил Индии, чтобы испачкатьсосудистую структуруPPs 6 , или микроскоп, будучи монофокальные7. В последние годы, наблюдательный метод с использованием некоторых фотоконвертируемых флуоресценции белка трансгенных животных, таких как мышей Kaede уточнили систематические клеточные движения in vivo8. Другое исследование уточнило CD69 независимое отключение лимфоцитов выход из PPs9. Мы использовали конфокальцированную микроскопию лазерного сканирования (CLSM) из-за ее высокой аналитической способности. Теперь мы можем легко получить изображения с высоким разрешением и использовать их для анализа динамики лимфоцитов.
В этом докладе мы продемонстрировали ряд методов оценки миграции лимфоцитов в PPs. Во-первых, мы показали усовершенствованные методы каннуляции грудного протока для сбора лимфоцитов. Во-вторых, мы усовершенствовали методы наблюдения несколькими способами поддержания объективных органов, когда это возможно, под микроскопическим наблюдением, что позволило нам получить высококачественные изображения в течение 3 часов. В-третьих, мы количественно клеточной миграции лимфоцитов для оценки последствий некоторых лекарств. Эти измененные протоколы будут способствовать разработке мукосал иммунологических оценок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол для сбора наивных кишечных тропических лимфоцитов и наблюдения за их миграцией в крысиных PPs. Эти процедуры могут выявить, как лимфоциты движутся в микроваскулатуре PPs и дать возможность визуально сравнить их динамику при нормальном или лекарственном состоян?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национального медицинского колледжа обороны и грантом на исследования в области здравоохранения и трудовых наук для исследования неразрешимых заболеваний от Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
Riferimenti
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer’s Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer’s patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
