ラット・ペイアーのパッチにおけるリンパ球ダイナミクスの顕微鏡観察
Summary
ここでは、経胸管リンパ球を採取し、ラット・ペイアーのパッチ中の腸管リンパ球の移動をタイムラプス写真を用いて3時間観察するための正確な方法について述べた。この技術は、炎症性条件下でリンパ球の動態がどのように影響を受けるかを明らかにすることができる。
Abstract
ナイーブリンパ球は、生理学的状態下で血液からリンパ組織に再循環し、腸免疫における重要な現象として一般的に認識されています。ペイヤーのパッチ(P)や腸間膜リンパ節などの二次リンパ器官の間質は、ナイーブリンパ球が抗原を感知する場所である。ナイーブリンパ球は、高い内皮小静脈、PPへの参入のポータルに到達するために血流を循環します。一部の免疫調節剤はリンパ球の移動に影響を与えると推定されるが、微小循環ダイナミクスの正確な評価は非常に困難であり、生体内でリンパ球の移動を観察する方法を確立することは、正確なメカニズムの解明に寄与することができる。リンパ管からリンパ球を採取し、ラットPの腸管-熱帯リンパ球の詳細なダイナミクスを観察する方法を改良した。生体内でラットPを観察する共焦点レーザー走査顕微鏡を選び、タイムラプス写真を用いて記録しました。リンパ球動態の解析に貢献できる鮮明な画像を得ることができるようになりました。
Introduction
ペイアーのパッチ(P)は、小腸の層状層の数百のリンパ卵胞で構成されています。PPは、卵胞、卵胞間領域、および卵胞の下部に位置する胚葉中心に分けられ、そこでリンパ球は抗原提示によって刺激される。不十分なリンパ管はなく、抗原は上皮細胞層を介して腸管腔から層状のプロプリアに侵入する。リンパ様卵胞を覆う上皮領域は、毛包関連上皮と呼ばれ、その中に特殊な散在するM細胞が粘膜抗原を取り込む。M細胞は、その後、高等内皮細胞(HEV)の内皮を介してPに流入する素朴なリンパ球に向かって提示される、発光側および抗原からの抗原を取り込む。PPは腸内免疫に重要な役割を果たし、炎症の初期段階に関連しています。多くの分子相互作用は、接着分子、ケモカイン2、3、およびスフィンゴシン-1リン酸4を含む、二次リンパ系器官(SLA)へのリンパ球の入り口を含む。したがって、多くの期待される治療標的がある。したがって、PP内のリンパ球ダイナミクスを観察することで、炎症の非常に初期の段階を垣間見ることができ、いくつかの有望な薬物の有用性を調べることができます。
この方法は、いくつかの手順(胸管5 へのカヌリン化および採取されたリンパ球への注射後のリンパ球および長期観察)を含む、PPにおけるリンパ球の移行に焦点を当てています。これらの手順は複雑で、これまでのレポートで各手順がどのように実行されたかを正確に確認することは困難であったため、ここで、観察を成功させるためのヒントをいくつか挙げた。例えば、胸部管への管のカヌレーションは非常に困難であり、そして、カヌリン化の最初の成功率は50%未満であった。しかし、我々は方法を改善し、80%を超える成功率を達成しました。我々は、いくつかの条件下でリンパ球の経経皮移動の定量的評価を可能にするために成功した観察に必要な他のいくつかのヒントをこの原稿で述べた。
これまでの報告では、インドのインクを静脈内注入してPP6の血管構造を染色する、または顕微鏡が単焦点7であるなど、時間の経過に伴う3次元的変化を理解することは困難であった。近年、Kaedeマウスのようないくつかの光変換可能な蛍光タンパク質トランスジェニック動物を用いた観察法が、生体内における系統的な細胞の動きを明らかにしている。もう一つの研究は、PPs9からのリンパ球出口のCD69独立したシャットダウンを明らかにした。分析能力が高いため、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を使用しました。今では、高解像度の画像を簡単に取得し、リンパ球ダイナミクスを分析するためにそれらを使用することができます。
本報告では、PPにおけるリンパ球移動を評価するための一連の方法を示した。まず、リンパ球を採取する胸部管缶取の精製方法を示した。第2に、顕微鏡観察の下で可能な限り目的の器官を維持するために、いくつかの方法で観察方法を改善し、3時間の高品質な画像を得ることを可能にしました。第三に、リンパ球移動の細胞の動きを定量化し、いくつかの薬の効果を評価した。これらの改変されたプロトコルは、粘膜免疫学評価の開発に寄与する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ナイーブな腸管熱帯リンパ球を収集し、ラットPでの移動を観察するためのプロトコルについて説明しました。これらの手順は、リンパ球がPの微小血管構造でどのように動くかを明らかにし、正常または薬用状態下でそれらのダイナミクスを視覚的に比較することを可能にする。これらのダイナミクスの直接観察は、観察期間は数時間に制限されているが、いくつかの薬物による?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、厚生労働省の難病研究に対する厚生医療大学の助成金や厚生労働科学研究助成金によって支援されました。
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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