쥐 페이어의 패치에서 림프구 역학의 현미경 관찰
Summary
여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.
Abstract
순진한 림프구는 생리적인 조건 하에서 림프구에 혈액에서 재순환하고 일반적으로 창 자 면역에 중요 한 현상으로 인식. Peyer의 패치 (PPs) 또는 막질 림프절과 같은 이차 림프구의 기질은 순진한 림프구가 항원을 감지하는 곳입니다. 순진한 림프구는 높은 내피 정맥, PPs에 입력의 포털에 도달하기 위해 혈류를 통해 순환. 일부 면역 조절기는 림프구 이동에 영향을 미치는 것으로 추정되지만, 미세 순환 역학의 정밀한 평가는 매우 어렵고 생체 내에서 림프구 이동을 관찰하는 방법을 확립하는 것은 정밀한 메커니즘의 해명에 기여할 수 있다. 우리는 림프덕에서 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서 장 열대 림프구의 상세한 역학을 관찰하는 방법을 정제했습니다. 우리는 생체 내에서 쥐 P를 관찰하기 위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사를 선택하고 시간 경과 사진을 사용하여 기록했습니다. 이제 림프구 역학 분석에 기여할 수 있는 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.
Introduction
Peyer의 패치 (PPs)는 소장의 라미나 프로프리아에 있는 림프성 여포의 수백으로 이루어져 있습니다. PPs는 여포, 간 간 지역 및 항원 프리젠 테이션에 의해 림프구가 자극되는 여포의 하부에 위치한 발아 센터로 나뉩니다. 포신성 림프관이 없으며 항원들은 상피 세포 층을 통해 장 루멘에서 라미나 프로프리아를 침범합니다. 림프모를 포함하는 상피 영역은 모낭 관련 상피라고하며, 그 내에서 전문화된 M 세포가 점막 항원들을 섭취합니다. M 세포는 발광측과 항원으로부터 항원에서 항원에서 복용한 다음 수지상 세포에 의해 포획되고 높은 내피 정맥(HEV)의 내피성 정맥을 통해 PPs로 흐르는 순진한 림프구를 향해제시된다. PPs는 장 면역에 있는 중요한 역할을 하고 염증의 초기 단계와 관련있습니다. 많은 분자 상호 작용은 접착 분자, 케모키인2,3및스핑고신-1-인산염4를포함하여 이차 림프구 기관(STO)에 림프구의 입구를 포함합니다. 따라서, 많은 예상 된 치료 대상이 있다. 따라서, PPs 내의 림프구 역학을 관찰하면 염증의 초기 단계를 엿볼 수 있으며 여러 유망한 약물의 유용성을 검사 할 수 있습니다.
여기서 방법은 여러 절차 (흉부 덕트5로 의 통조림 및 수집 된 림프구로 주입 한 후 림프구 및 장기 관찰을 수집)를 포함하는 PPs에서 림프구의 이동에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 절차는 복잡하고 이전 보고서에서 각 절차가 수행된 방법을 정확하게 확인하기 가 어려웠기 때문에 성공적인 관찰을 달성하기 위한 몇 가지 팁을 여기에서 언급했습니다. 예를 들어, 흉부 덕트로 튜브의 캐니언은 매우 어려웠으며, 캐너레이션의 초기 성공률은 50% 미만이었습니다. 그러나, 우리는 방법을 개선하고 80 %를 초과하는 성공률을 달성했다. 우리는 여러 조건하에서 림프구의 경전 적 이동의 정량적 평가를 가능하게 하기 위하여 성공적인 관측을 위해 필요한 이 원고에 있는 몇몇 다른 팁을 언급했습니다.
이전 보고서에서는, PPs6의혈관 구조를 얼룩지게 하기 위해 인도 잉크의 정맥 주사와 같은 시간이 지남에 따라 3차원 변화를 이해하기 어려웠다, 또는 현미경은 단일 초점7인. 최근에는 Kaede 마우스와 같은 일부 광변환형 형광 단백질 트랜스제닉 동물을 이용한 관측 방법이 생체 내에서 체계적인 세포 움직임을 명확히하였다 8. 다른 연구는 PPs9에서림프구 송구의 CD69 독립적 인 종료를 명확히. 우리는 높은 분석 기능 때문에 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)를 사용했습니다. 이제 우리는 쉽게 고해상도 이미지를 얻고 림프구 역학을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
이 보고서에서는 PP에서 림프구 마이그레이션을 평가하는 일련의 방법을 시연했습니다. 첫째, 우리는 림프구를 수집하기 위해 흉부 덕트 캐너레이션의 세련된 방법을 보여 주었다. 둘째, 현미경 관찰하에 가능한 한 객관적인 장기를 유지하는 여러 가지 방법으로 관찰 방법을 개선하여 3시간 동안 고품질 이미지를 얻을 수 있게 했습니다. 셋째, 림프구 이동의 세포 움직임을 정량화하여 일부 약물의 효과를 평가했습니다. 이러한 수정된 프로토콜은 점막 면역학 평가의 발달에 기여할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 순진한 창자 열대 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서그들의 이주를 관찰하기위한 프로토콜을 설명했다. 이 절차는 림프구가 PPs의 microvasculature에서 어떻게 움직이는지 밝히고 정상 또는 약용 조건하에서 그들의 역학을 시각적으로 비교하는 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 역학의 직접적인 관찰은 관측 기간이 불과 몇 시간으로 제한되지만 일부 약물에 의한 면역 학적 수정에 대한 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국방의과 대학의 보조금과 일본 보건복지부의 난치성 질병에 대한 연구를 위한 보건 노동과학 연구 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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